质粒DNA的小量制备实验
实验方法原理 当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。碱裂解法是最常用的小量制备质粒DNA的方法。
实验材料 细菌克隆
试剂、试剂盒 LB培养基抗生素葡萄糖TrisEDTA NaOHSDS乙酸钾乙醇水
仪器、耗材 离心机试管离心管制冰机
实验步骤
1. 接种一个单菌落于5 ml无菌LB培养液中,在37°C培养至饱和状态(过夜)。
2. 取1.5 ml培养液以最大转速离心20 s。弃上清。
3. 沉淀用100 μl GTE溶液彻底重悬并于室温静置5 min。
4. 加人200 μl NaOH/SDS溶液,用指头敲击管壁混匀,于冰上放置5 min。
5. 加人150 μl乙酸钾溶液,在涡旋混合器上振荡2 s混匀,于冰上放置5 min。
6. 离心3 min,然后吸取上清液移人干净的微量离心管中,加0. 8 ml 95%乙醇,于室 温静置2 min。
7. 室温离心1min ,弃上清,用1 ml 70%的乙醇清洗沉淀,然后真空干燥。
8. 沉淀用30 μl TE缓冲液重溶,于4°C短期保存,于-20°C或-70°C长期保存,取 2. 5-5 μl进行酶切分析。
注意事项
1. 如有必要,在酶切反应液中加人1 μl 10 mg/ml RNA酶溶液(不含DNA酶)以去除污染的RNA。