金属螯合亲和层析实验
天然MCAC纯化带组氨酸尾的可溶性融合蛋白
变性条件下用MCAC纯化带组氨酸尾的不溶性融合蛋白
| 实验材料 | 蛋白质 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | IPTG NiSO4 蛋白酶抑制剂 MCAC-EDTA Triton |
| 仪器、耗材 | 层析柱 转子 |
| 实验步骤 |
1. 接种含以pET载体表达带组氨酸尾融合蛋白的大肠扦菌BL21（DE3）pLyaS菌株于10 ml M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基。于37℃摇荡培养过夜。
3. 加入1 ml 0.1 mol/l IPTG，干37℃继续培养1~3 h。 往一根1.5 cm×10 cm 层析柱中加入1 ml NTA介质，让液体刚好流至柱床的顶部， 用下列液体洗柱： 0.5 ml （3个床体积）去离子水 0.5 ml （5个床体积）50 mmol/l NiSO4·6H2O 0.5 ml MCAC-0缓冲液 6. 将菌体沉淀置于冰浴中冻融，加入5 ml MCAC-0缓冲液和33 μl 150×蛋白酶抑制剂混合液。用吸管吹打重悬，超声破菌或匀浆。
8. 在冰浴中冻融细胞悬液。于260 000 g 离心60 min，将上清吸至在冰浴中的干净容器，弃沉淀。取10 μl 小份样品冻结于-70℃，留待以后分析之用
11. 以分段冼脱的方式分别依次用5 ml 下列缓冲液冼柱：MCAC-20、MCAC-40、MCAC-60、MCAC-80、MCAC-100、MCAC-200、MCAC-1000。分部收集每1 ml 洗脱液，保留待SDS-PAGE分析。
12. 在10~15 ml/h 的流速下以5 ml MCAC-EDTA缓冲液洗柱，收集毎1 ml 级分。
13. 分析各级分中所含的冼脱蛋白。
14. 合并含洗脱蛋白质的级分，取出10 μl 用SDS-PAGE分析。必要时，透析除去MCAC缓冲液。将样品分成小份，在-70℃或液氮中冻结。
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