镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书（一）
一、 简介
金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。
镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。
二、 性能参数：
特点 | 基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便 |
基质 | 6%的交联琼脂糖凝胶 |
配体 | Ni2+ |
配体密度 | 20-40μmol /ml |
吸附载量 | 15mg蛋白/ml |
介质颗粒大小 | 45-165μm |
最大流速 | 15000px/h |
pH范围 | 3-10，在位清洗时pH范围可到2-11 |
保存温度 | +4-8℃ |
保存液体 | 20%乙醇 |
三、 适用范围
分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。
四、 应用实例
实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白
实验步骤：
1、Ni-NTA 装柱，1.6×500px，柱床体积为10ml；
2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；
3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；
4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；
5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4-8℃环境中保存。
缓冲液组成：
缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g, 加适量水溶解后定容到1000ml。
缓冲液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g, 加适量，水调pH后定容到1000ml。
缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制：
咪唑浓度 | 缓冲液1量(ml) | 缓冲液2量(ml) |
10 mM | 98 | 2 |
20 mM | 96 | 4 |
50 mM | 90 | 10 |
100 mM | 80 | 20 |
200 mM | 60 | 40 |
300mM | 40 | 60 |
400 mM | 20 | 80 |
SDS-PAGE流程：
1、BCA法测量样品蛋白浓度
2、根据测定样品的蛋白浓度，算出5~10μg/孔所需的体积。
3、向1.5ml EP管中加入含5~10μg蛋白的样品溶液，若体积小于10μl，则加20mM PBS pH7.4补足10μl；若体积大于10μl，则要加入1ml无水乙醇，－20℃下浓缩1h。
4、取浓缩样品10000rpm离心15min，除去上清，37℃烘箱10min去除残余的乙醇。
5、在样品加入20mM PBS pH7.4和2×loading buffer各10μl，100℃下10min。取出后冷却30s，4000rpm离心1s。
6、点样，电泳。
实验结果：
（1）使用Ni-NTA Agarose纯化His标签重组蛋白
His标签重组蛋白的上样量为20ml，用分别含20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液B进行洗脱，色谱结果见图1，色谱各组分的SDS-PAGE结果见图2。
图1. Ni-NTA Agarose纯化带His标签重组蛋白色谱图
图2. SDS-PAGE 图谱
