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金属螯合亲和层析实验（二）

2019.3.28

实验材料	蛋白质
试剂、试剂盒	GuMCAC-EDTA缓冲液盐酸胍
仪器、耗材	转子离心机
实验步骤	1. 制备表达带组氨酸尾的融合蛋白的大肠杆菌菌体沉淀。 2. 准备NTA介质层析柱，但柱子最后以GuMCAC-0缓冲液洗涤. 3. 在冰浴中冻融菌体沉淀。加5 ml GuMCAC-0缓冲液，用吸管抽吸重悬，超声破菌或匀浆。在-70℃冻结10 min，室温冻融。 4. 用振摇器、旋转混合器或磁力搅拌器轻柔地混匀样品60 min，在4 ℃ 27 000 g 离心30 min 将上清吸至一个干净的容器并弃沉淀。取10 μl 小份样品留待SDS-PAGE分析。 5. 如果提取液被冻结，室温冻融，以10~15 ml/h 的流速上Ni²⁺-NTA柱。收集流出液，取10 μl 小份样品留待SDS-PAGE分析。 6. 以20~30 ml/h 的流速用5 ml GuMCAC-0缓冲液洗柱，弃流出液。 7. 以分段冼脱的方式分别依次以5 ml 下列缓冲液冼柱：GuMCAC-20、GuMCAC-40、GuMCAC-60、GuMCAC-80、GuMCAC-100、GuMCAC-500。分部收集每1 ml 洗脱液，保留待SDS-PAGE。 8. 在10~15 ml/h 的流速下以5 ml GuMCAC-EDTA缓冲液洗柱，收集每1 ml 级分。 9. 确定含蛋白祥品的组分，合并之。将祥品透析或保存于-70℃。 10. 准备合适的最终蛋白溶解溶液（如用于蛋白质切割断裂或长期保存），并加入盐酸胍至4 mol/l 终浓度。在4℃对1 000 ml 该含4 mol/l 盐酸胍的缓冲液透析2 h 以上。 11. 倒出500 ml 上述含胍的缓冲液，再加入不含胍的缓冲液，重复透析。 12. 将透析袋移至1 000 ml 不含盐酸胍的新鲜缓冲液，4℃透析2 h 或过夜。 13. 从透析袋中取出蛋白溶液，分装成小份，在-70℃或液氮中冻结。 14. 分析各分部收集的级分并处理蛋白。展开