真菌DNA的提取方法介绍
一、真菌DNA的提取(方法一)
1.实验试剂
(1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS
(2)3M NaAc
(3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA
(4)酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)
(5)氯仿:异戊醇(24:1)
(6)异丙醇
(7)无水乙醇
(8)75%乙醇
(9)RNaseA
2.实验步骤
(1)取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
(2)加入4mL提取液,快速振荡混匀
(3)加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3～5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本)
(4)1000rpm,4℃,5min
(5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃离心5min)
(6)取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
(7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中
(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL),37℃处理1h
(9)用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
(10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上
(11)沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用
二、真菌DNA的提取(方法二)
1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次
3.加入1mL 5M KAc,冰浴20min
4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中
7.加入1ul RNaseA(10mg/mL),37℃处理1h
8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用
DNA提取缓冲液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V),PVP和巯基乙醇使用前加入5M KAc
方法一和二,是大同小异.主要是DNA提取液配方不一样!成本也不一样!
