方案3 多蛋白质复合体的非变性琼脂糖凝胶电泳实验
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、非变性凝胶的制备
（1）将琼脂糖粉末加到有 3?4 倍体积的非变性凝胶缓冲液的锥形瓶中，称重。 （2）用倒置的烧杯盖住锥形瓶，放到微波炉中加热，直至琼脂糖熔化。 （3）再称重，如必要加水补到原来的重量。 （4）让琼脂糖在 45°C 水浴中冷却。 （5）把梳子插到凝胶灌制装置中央，倒入琼脂糖溶液。 （6）让琼脂糖凝固。 （7）把凝胶放入装有非变性凝胶缓冲液的水平电泳装置中，保证凝胶完全浸没。 小心拔出梳子。 二、蛋白质复合体的鉴定2.用纯化的蛋白质在有利于蛋白质复合体形成的条件下，共同温育目标蛋白。 要确定细胞提取物中的蛋白质是否能与目标蛋白结合。在适于形成蛋白质复合体的条件下，取 45]ug 溶解的细胞提取物与 5ug 的纯化蛋白一起温育。 3.用 2X 上样缓冲液以 1:1(体积比）混合蛋白样品，每份 2~5ug。 蛋白样品应该包括每个单独蛋白（或使用的细胞提取物），在第②步骤中将混合物孵育。 4.加样到加样孔中（一般约 20ul 孔），室温下恒压 50V 电泳 lh。 5.在染色液中，染凝胶 20 min。在脱色液中脱色，直到能清晰地辨别蛋白条带 (图 10.16)。 6.在甘油中泡 5 min，37°C 在两层玻璃纸间干燥 24 h 以干燥凝胶。 三、蛋白质复合体的组分的分离和鉴定7.在相邻泳道中，加 2 个相同的蛋白质复合体样品到 0.8% 琼脂糖凝胶，室温下恒压 50V 电泳 lh。 8.用锋利的刀片从凝胶上分离 2 个泳道的凝胶。 9.按步骤⑤染 2 个泳道中的一个泳道胶条。另一个泳道的胶条浸在非变性凝胶缓冲液中（缓冲液 A)。 10.鉴定含有蛋白质复合体的染色凝胶区域。从对应蛋白质复合体位置的未染色凝胶区域，切下琼脂糖条带，作为染色凝胶参照。 11.把含有复合体的未染色凝胶碎片放入 Ultrafree-DA 装置中。装置中的凝胶喷雾器能通过离心，把凝胶条转化成细小的喷雾。把过滤装置放到滤瓶中，室温或 4°下 5000 g 离心 lOmin。凝胶碎片必须通过喷雾器的口，以便将凝胶转变为细小泥浆。 凝胶颗粒通过过滤器被捕获，然后弃掉（过滤器不可重复使用）。 12.将过滤瓶中的蛋白质样品转移到微型超滤浓缩器中（所用的截点大小，由所研究的蛋白质的大小决定）。 13.14000 g 离心微量浓缩器，直至样品体积剩到 10~20ul。 蛋白质保留在微量样品储存池的膜上。 14.把微量管倒置在新的瓶中，回收浓缩蛋白质。l000 g 离心 3 min。 细节参见供应商的说明书。 15.鉴定蛋白质复合体条带各组分的大小，用 SDS-PAGE 分析浓缩的蛋白质（见第 2 章方案 1)。 凝胶中丙烯酰胺的百分比，取决于要研究的蛋白质的大小（见第 2 章表 2.2)。 或者，可用 ESI-MS 或 MALDI-MS 分析蛋白质（要求约 4Pmol)(见第 8 章）。 展开 |
