细胞组分的分析方法——定量细胞化学分析技术-2
5.固定方法
(1)福尔马林法：
在单细胞悬液中加入等体积含8％甲醛的盐水G，4℃下固定12至18小时。该法常用于Acriflavine-Feulgen染色。
(2)乙醇法：
细胞被重新悬浮于5ml冷盐水G中，慢慢加入-20℃95％的乙醇15ml，其最终浓度为70％，冰浴30分钟。此法常用于EB及PI染色。
(3)丙酮法：
细胞悬浮于冷生理盐水中，慢慢加入冷丙酮，使其最终浓度为85％。此法常用于病毒抗原的免疫荧光研究。
在流式细胞光度术中最常用的荧光染料有20余种。其中包括抗生素类的光神霉素和色霉素、Feulgen形试剂Acriflavine和核酸插入剂EB及PI(Ethidium Bromide，Propidium Iodide)。
(1)Aeriflavine－Feulgen染色法：
器材和试剂：4mol/LHCl；普通离心机；Acrmavine－Feulgen染色液；盐酸—乙醇液。
步骤：①经福尔马林固定的细胞低速度离心后弃上清；②用蒸馏水冲洗1次，然后以4当量盐酸在室温水解20分钟；⑧离心后弃上清并以蒸馏水冲洗1次；④把细胞重新悬浮于Acriflavine—Feulgen染色液中，室温静置20分钟；⑤离心弃染色液，并用盐酸—乙醇液至少洗3次；⑥如做细胞体积测定或细胞分类可将样品悬浮于蒸馏水中，如进行细胞周期分析则悬浮于生理盐水中。
(2)EB及PI染色法：
器材和试剂：普通离心机；恒温水浴箱；RNA酶溶液。
步骤：①经乙醇固定的样品用RNA酶处理30分钟，37℃水浴；②离心后弃RNA酶，用冷蒸馏水洗1次；⑧在冰浴中用EB或PI染色液染色20分钟；④离心并弃染液，重新悬浮于蒸馏水或生理盐水中。
为缩短染色时间并提高染色特异性，Krishan介绍了一种将细胞直接悬浮于PI的低渗液中的染色法，这样可以破坏细胞膜直接染核染色质。用此方法得到的单细胞DNA组方图与用常规方法得到的结果基本相同。方法如下：细胞经150g离心5分钟；细胞直接悬浮于PI低渗液中，4℃5～10分钟；直接进行FCM分析。
(3)DNA－蛋白质双染色法：
对细胞进行多参数分析时，常对DNA－RNA或DNA－蛋白质进行双染色。测量后可获得一组细胞内蛋白质或RNA或DNA的含量，以及各种含量细胞数量之间的关系的三维组方图。下面以DNA/蛋白质(PI/FITC)染色为例(Crissman et al．1976)。
器材和试剂：恒温水浴箱；普通离心机；RNA酶溶液；FITC染液；PI染液。
步骤： ①经70％乙醇固定的L1210白血病细胞；②在37℃，用RNA酶液处理30分钟；⑧离心后弃上清，并用蒸馏水洗1次；④先用FITC染液染30分钟；⑤离心后用蒸馏水洗1次；⑥再用PI染液染20分钟，冰浴；⑦蒸馏水洗1次并重新悬浮于生理盐水中，⑧进行FCM分析。
(1)在样品制备过程中要尽量减少离心次数，以避免产生细胞团块和丢失细胞。
(2)要避免过长时间的固定并把细胞外的染料洗干净，以减少荧光本底。
(3)勿用下列固定剂：冰醋酸—乙醇，它能引起大量细胞丢失；苦味酸，因其本身发荧光并很难从细胞里去掉汞化合物，因其在细胞内形成结晶。
(4)在进行双染色时尽量选用激发光谱不接近的荧光染料。
(5)在进行细胞周期分析时，如CV值过大将导致非特异的胞浆染色。
(1)PBS溶液：NaCl 1800mg、KCl 200mg、Na2HPO4 1150mg、KH2PO4 200mg、蒸馏水1000ml。
(2)胰蛋白酶溶液：NaEDTA液4ml(贮存液：1gNaEDTA溶于100ml蒸馏水)，每个包装胰蛋白酶(Difco)先加10mlPBS溶解，再加186mlPBS液，用前以0．2μm滤器过滤。
(3)Hank's平衡盐水：NaCl、KCl 80g、40g、CaCl2 0.14g、MgCl2 0．10g、MgSO4 0．10g、Na2HPO4 0．06g、KH2PO4 0．06g、酚红0．006g、葡萄糖1．00g、NaHCO3 0．35g，以上各成份依次溶于1L蒸馏水中，10～15磅消毒20分钟，4℃冰箱保存。切勿摇动，以免出现碳酸钙沉淀。
(4)分离液：EDTA 0．5mmol/L，每毫升生理盐水-GM溶0．1mg胰蛋白酶。
(5)中和液：每毫升生理盐水中含0．2mg大豆胰蛋白酶抑制剂、DNA酶10．01mg、BSA 1mg。
(6)磷酸缓冲液：0．05mol/L蔗糖、0．14mol/L NaCl、0．002mol/L Na2HPO4。以NaHCO3调节pH。
(7)TPB分离液：TPB(K and K Laboratories Inc)为1％水液，冰冻保存，用前以蔗糖—盐溶液稀释。
(8)生理盐水-GM液：葡萄糖1．1g、NaCl 8g、KCl 0．4g、Na2HPO4·12H2O 0．39g、KH2PO40．15g依次溶于蒸馏水1000ml中。
(9)盐水G：MgSO4·7H2O 1．5g、CaCl2·2H2O 0．16g依次溶于1000ml生理盐水－GM中。
(10)Acriflavine—Feulgen染液：Acriflavine 0．2mg/ml偏重亚硫酸钾5mg/ml。
(11)盐酸—乙醇溶液：1ml浓盐酸加99ml 70％乙醇。
(12)RNA酶液：RNA酶10mg(Sigma)、Na2HPO4·7H2O 55．6mg、NaH2PO4 168．9mg，溶于10ml蒸馏水。
(13)PI低渗液：PI0．05mg/ml，0．1％枸橼酸钠水溶液。
(14)FITC染液：FITC 0．05mg/ml的0．5mol/L NaHCO3溶液。
(15)PI染液：0．1mg/ml的PBS溶液。
(16)色霉素—A3染液：CA3 1Omg、MgCl2·6H2O 1．5g在4℃溶于500ml蒸馏水(CA3不能在温水中溶解)。
(17)EB染液：1％的水溶液或1％的PBS液。
细胞显微分光光度术(microspectrophotometry)是利用细胞内某些物质对特异光谱吸收的原理，用来测定这些物质如核酸与蛋白质等在每一个细胞内含量的一种实验技术，如DNA对紫外线最高吸收波长是260 nm。也可经过特异的染色反应，如DNA经Feulgen染色反应后就可以吸收波长为546nm的可见光波段，与分光光度仪测定溶液成分的方法相比，这种技术不仅可以定位，而且可以灵敏地测出一个细胞内某种成分的含量。
细胞显微分光光度测定法可分为紫外光显微分光光度测定法与可见光显微分光光度测定法。前者是利用细胞内某些物质对紫外光某波段特有的吸收曲线来测定相应物质的含量；后者则是根据某种物质特异的染色反应，然后再测定其对可见光某特定波段的吸收能力来进行对该物质的定量测定。
