强大的基因组编辑工具-Crisp/cas9（二）
三、 产品推荐
针对sgRNA和cas9，我们有如下产品可供选择哦：
1.sgRNA系列。
（1）sgRNA载体类型
| 货号 | 载体 | 启动子 | sgRNA | 是否含有Cas9核酸酶基因 | 筛选标记/报告基因 |
| SG001 | pCRISPR-SG01 | U6 | 1 或多个 | 无，Cas9克隆单独出售 | Hygromycin |
| SG002 | pCRISPR-LvSG03 | U6 | 1 或多个 | 无，Cas9克隆单独出售 | Puromycin / mCherry |
| SG012 | pCRISPR-CG02 | U6 | 1 | 有，载体含有CBh启动子启动表达的Cas9核酸酶基因 | N/A |
| SG013 | pCRISPR-CG04 | U6 | 1或多个 | 有，载体含有CMV启动子启动表达的Cas9核酸酶基因 | Neomycin / copGFP |
| SG014 | pCRISPR-CG07 | U6 | 1 | 有，载体含有CBh启动子启动表达的Cas9核酸酶基因 | copGFP |
| SG015 | pCRISPR-CG08 | U6 | 1 | 有，载体含有CBh启动子启动表达的Cas9核酸酶基因 | mCherry |
| — | pCRISPR-CG12 | U6 | 1或多个 | 有，载体含有CMV启动子启动表达的Cas9核酸酶基因 | Neomycin / mCherry |
*配合单独表达Cas9 核酸酶(Cat.No. CP-C9NU-01, CP-LvC9NU-01, CP-LvC9NU-02, CP-LvC9NU-08, CP-LvC9NU-09, CP-LvC9NU-10)或 Cas9 D10A切口酶(Cat.No.CP-C9NI-01, CP-C9NI-02) 的 Cas9克隆使用。
还有有上述货号对应搭配使用的sgRNA乱序对照哦
| 货号 | 产品 | 筛选标记 | 报告基因 |
| CCPCTR01-CG02 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02. | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02. | N/A |
| CCPCTR01-CG04 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04 | |
| CCPCTR01-CG07 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07 | |
| CCPCTR01-CG08 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 with mCherry | |
| CCPCTR01-LvSG03 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03 | mCherry |
| CCPCTR01-SG01 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01 | N/A |
（2）还有sgRNA乱序对照慢病毒颗粒
| 货号 | 产品 | 描述 | 启动子 | 筛选标记 | sgRNA |
| LPP-CCPCTR01-LvSG03-100 | sgRNA 对照 CCPCTR01-LvSG03 的纯化慢病毒颗粒（25 µL×4管） | 108 TU/ml sgRNA 对照 CCPCTR01-LvSG03 的纯化慢病毒颗，转导级 | EF1a | Puromycin | CCPCTR01-LvSG03 |
| LPP-CCPCTR01-LvSG03-400 | sgRNA 对照 CCPCTR01-LvSG03 的纯化慢病毒颗粒（100µL，25 µL×16管） | 108 TU/ml sgRNA 对照 CCPCTR01-LvSG03 的纯化慢病毒颗，转导级 | EF1a | Puromycin | CCPCTR01-LvSG03 |
图3. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T细胞中的HUWEI基因。（A）HUWEI-sgRNA与基因组PCR引物设计；（B）在6孔板中，HUWEI-sgRNA/Cas9克隆与sgRNA/Cas9对照克隆（泳道2）转染HEK293T细胞。转染40h后收集细胞，提取基因组DNA并用HUWE特异的PCR引物进行PCR扩增，凝胶纯化PCR产物，将纯化后的产物与缓冲液混匀，经变性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI经PCR后的产物片段长度应为520bp，T7 ENI剪切后的产物应分别为330bp和190bp。
图4. CRISPR-Cas9多重靶向编辑多个基因。实验组（1-4泳道）为Cas9表达克隆及分别表达靶向p53, HUWE1, NCL3 和
GFP基因的sgRNA克隆质粒共转染HEK293t
GFP稳转细胞。对照组（5-8泳道）为Cas9表达克隆质及随机sgRNA表达克隆的质粒共转染HEK293t
GFP稳转细胞。通过T7核酸内切酶检测分析基因组DNA各个靶点上同时存在的插入缺失。*号标记的条带显示Cas9核酸酶及分别靶向多个靶点的sgRNA都在目标靶点上有效地诱发了插入缺失突变（1-4道）。PCR产物条带及T7核酸内切酶酶切产物条带大小：GFP:
720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切);
HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp
(酶切).
（3）sgRNA 文库
图5. A：混合文库筛选。对感染了sgRNA混合文库的细胞株进行筛选，获取具备目的表型的阳性细胞株进行Sanger测序识别对应的sgRNA，或通过深度测序搜索比例过高或过低的sgRNA。B：使用 sgRNAs 文库array（独立克隆文库）进行基因敲除筛选。各板孔里的细胞株分别感染不同的sgRNA慢病毒颗粒，并筛选具备目的表型的阳性细胞株。如此无需测序即可获知与目的表型相关的sgRNA。
