shrna引物退火原理
1. 载体取2-5ug，在25ul体系中，用2.5ul的酶切30min-1h，回收载体：
载体:---2ul（2-5ug）
酶---------2.5ul
Buf--------2.5ul
水---------18ul
回收的时候希望浓度高点。
2. Oligo退火形成双链
若为2OD=5.4nmol的话，则每个引物用54ul水溶解，即得到浓度为100uM（100pmol/ul）的溶液。
取两引物各10ul，10X NEB Buf-2取2.2ul，混匀，PCR仪缓慢退火至室温（>60min）。
程序如下：
95℃--------5min；
94~46℃--降1℃/min
46~26℃--降2℃/min
4℃---------forever
3. linker的5’端磷酸化
退火产物-------------0.5ul (50pmol总5’末端)
10x PNK Buf A-------2ul
10mM ATP------------2ul
T4 PNK酶------------1ul
ddH2O----------------14.5ul
以上总计20ul，混匀（不可votex），37度30min。
4. 连接
T4 DNA ligase法
酶切过载体----------100-200ng
磷酸化linker--------4ul 1:100稀释后的linker
T4 酶------------------1ul
T4 Ligase Buf---------1ul
PEG4000--------------1ul
加水补足总体积10ul，混匀，4度过夜。
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