免疫荧光细胞化学技术

免疫荧光细胞化学技术

免疫荧光细胞化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons等（1950）建立，经过近43年的发展，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞（或组织）化学。它与亲合化学技术如葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素与卵白素、植物血凝素（ConA等）相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机和扫描电视等技术结合发展为定量免疫荧光细胞化学技术；荧光激活细胞分类器（FACS）的应用使免疫荧光细胞化学技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。在免疫荧光细胞化学中应用单克隆抗体日益增多，将会不断提高特异性、敏感性和应用范围。激光扫描等聚集显微镜的应用又开创了新的发展时代。

　　由于免疫荧光细胞化学的特异性，快速性和在细胞和分子水平定位的敏感性与准确性，在免疫学、微生物学、细胞和组织学、病理学、肿瘤学以及临床检验学等生物学和医学许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。

第一节　免疫荧光细胞化学的原理

　　免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量（图3-1）。

图3-1　紫外光激发荧光物质放射荧光示意图

　　用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

　　免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。

　　一、直接法

　　1．检查抗原法 这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差（图3-2）。

图3-2 直接法

　　2．检查抗体法 将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。

　　二、间接法

　　1．检查抗体法（夹心法）　　此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。

　　2．检查抗体法　　用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待检血清，如果其中含有切片中某种抗原的抗体，抗体便沉淀结合在抗原上，再用间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必需用抗人IgG荧光抗体等），在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段（图3-3）

图3-3　间接法

　　3．检查抗原法双薄片　　此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体，种特异性）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗全显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3～5分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3至4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示。这是现在最广泛应用的技术。

　　三、补体法

　　1．直接检查组织内免疫复合物法　　用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体补体复合物---抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。

图3-4　补体法

　　2．间接检查组织内抗原法　　常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原补体抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体—抗补体荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的标记显示。

　　四、双重免疫荧光标记法

　　在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时，要进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。

　　五、对照试验

　　为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以上对照试验：

　　1．直接法　需设下述对照试验

　　（1）标本自发荧光对照：标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光（无与特异性荧光相似的荧光）。

　　（2）抑制试验：可分为二步法和一步法。

　　①二步抑制法：标本先加未标记的特异性抗体，再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。

　　②一步抑制法：先将荧光抗体用未标记抗体作适量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。此法效果较二步法好，并且简便。

　　（3）阳性对照：用已知阳性标本作直接法免疫荧光染色，结果应呈阳性荧光。

　　如对照（1）和（2）无荧光或弱荧光，（3）和待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。

　　2．间接法

　　（1）自发荧光对照：同上（一）。

　　（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。

　　（3）抑制试验：同上。

　　（4）阳性对照：同上。

　　如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本阳性则为特异性荧光。

　　3．补体法

　　（1）自发荧光对照

　　（2）荧光抗体对照

　　（3）抑制试验

　　（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1：10稀释先作用标本，再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。

　　（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再用1：10稀释度的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。

　　（6）阳性对照：（1）～（5）结果阴性，（6）和待检标本阳性时，则为特异性荧光。

第二节　荧光抗体的制备

　　荧光抗体是免疫荧光细胞化学的重要技术之一，制备高特异性和高效价的荧光抗体必须选用高质量的荧光素和高特异性高效价的免疫血清。

　　一、荧光素

　　荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止（一般持续10-7～10-8s）。可以产生明亮荧光的染料物质，称荧光色素。目前主要常用的荧光色素有以下3种：

　　（一）异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate, GITC）

　　呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm，呈现黄绿色荧光，分子量为398.4（图3-5）。

　　在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。反应式如下（图3-6）：

　　一个Ig分子上最多能 标记15～20个FITC分子。

图3-5　FITC的吸收光谱和发射光谱

图3-6　抗体的FITC标记反应式

　　（二）四乙基罗达明（tetraethylrodamine B200, RB200）

　　呈褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595～600nm,呈明亮橙红色荧光。分子量为580（图3-7）。

　　RB200在五氯化磷（PCl5）作用下转变成磺酰氯（SO2Cl），在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸ε-氨基反应结合而标记在蛋白分子上。化学反应式如下（图3-8）。

图3-7　RB200在可见光区的吸收　图3－8　RB200标记抗体反应

光谱和荧光光谱

图3-8　RB200标记抗体反应

　　（三）四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）

　　它是一种紫红色粉末，较稳定。其最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰（图3-9），与蛋白质结合方式同TITC。它可用于双标记示踪研究。化学结构式如下（图3-10）。

图3-9　TMRITC在可见光区的吸收

光谱和发射光谱

图3-10　 TMRITC结构式

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二、荧光素标记抗体的方法

　　（一）FITC标记抗体的方法

　　1．Marsshall 氏法

　　（1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25～50ml）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。

　　（2）方法及步骤：

　　①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。

　　②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg 荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。

　　③结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。

　　④透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（2500r/min）20min，除去其中少量之沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0～4℃）过夜。

　　⑤过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定（图3-11，图-3-12）。

图3-11　 Sephadex G-25 对FITC

图3-12　FITC与家兔IgG球蛋白在25℃和2℃时结合的动力学（Kawamura 1964）

　　洗脱液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）;过滤量:12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析);收集量:20ml(稀释1.7倍)。

　　分别以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸盐缓冲液（分别为pH9.5和pH9.0），于2℃下搅拌将其各加入100mg家兔IgG生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分为两半。一半保留于2℃下，另一半置25℃下。间隔一定时间后各取出0.5ml通过sephadex G-25去游离FITC，由上计算出5mg家兔IgG结合的FITC量。

　　2．Chadwick 氏法

　　（1）材料：抗原球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶（25ml）、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）、透析袋、棉线、玻棒等。

　　（2）方法及步骤：

　　①抗体准备：用0～4℃pH8.0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。

　　②荧光色素准备：按每毫克蛋白加入荧光素0.01mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶解。

　　③将准备之抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在0～4℃，冰箱中结合18～24h。

　　④透析和柱层析：方法同Marshall 氏法

　3．改良法（1963年） 　根据Marshall 氏法取高价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0.15mol/l NaCl）及缓冲液（0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0） 稀释使每毫升内含蛋白10mg,缓冲液为总量的10%，降温至4℃，加入异硫氰酸盐荧光素，（蛋白：荧光素=50～80mg:1mg），在0～4℃下电磁搅拌12～14h。然后用半饱和和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用Nessler氏试剂测验至隔夜透析之盐水无氨离子及荧光色素为止）。将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%,分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，-20℃保存可达2年以上。

　　【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCl 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸馏水中，校定pH至7.2。

　　【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5mol/l Na2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/l NaHCO3(4.2%)90ml,混合后，校定pH至9.0。

　　【附三】3%重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水重碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。

　　4．透析标记法　　 此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。