免疫荧光组织（细胞）化学技术：荧光抗体的质量控制
1、染色特异性和敏感性的测定方法
（1）特异性染色和效价测定
直接染色法中效价以倍比稀释如1：2、1：4、1：8……，与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“+++”的最大稀释度，为其染色滴度（效价）或单位。实际染色时，可取低一个或两个稀释度（即2~4个单位），如染色效价为1：64，实际应用时可取1：32或
1：16。间接染色法中效价可按抗核抗体荧光染色法步骤，先用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准，染色用效价和直接法相同。
（2）非特异性染色测定
根据荧光抗体的用途不同，可用类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异性染色，否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体。
（3）吸收试验
在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移入4℃冰箱过夜，3000r/min，离心30min，收集上清液，再用于相应抗原阳性标本染色，结果应不出现明显阳性荧光。
2、F/P比值的测定方法
F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F/P的克分子比值为1~2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，敏感性降低。
（1）蛋白质定量 测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量。
（2）结合荧光素定量 先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取FITC 1mg，溶于10ml 0.5mol/L
pH9.0碳酸盐缓冲液中，再用0.01mol/L pH7.2
PBS稀释到100ml，此时荧光素含量为10μg/ml。以此为原液，再倍比稀释9个不同浓度的溶液，用分光光度计在490nm波长测定光密度值（OD），以光密度为纵坐标，荧光素含量为横座标，作标准函数图。荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm，FITC和蛋白质结合后由490nm变为493-495nm，RB200和蛋白质结合后变为595nm。
F/P比值的计算：
F/P克分子比值=（FITC g/ml）/（蛋白质mg/ml）×（160000×103）/（390×106）=0.41×（FITC g/ml）/（蛋白质mg/ml）
式中160000为抗体蛋白质的分子量，390为FITC的分子量。蛋白质从克换算为毫克需再乘以103，而荧光素从克换算为微克需要再乘以106。
测定RB200荧光抗体的克分子比值公式如下：
RB200荧光抗体的克分子比值=[（RB200 g/ml×10-3）/580] /[（蛋白质mg/ml）/160000（IgG）]
TMRITC荧光抗体克分子量比值=A515nmOD/A280nmOD 或=重量比（g/g）×（160000/580）
3、荧光抗体的保存
以0~4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性。最好加入浓度为1：5000的硫柳汞或者 1：10000，叠氮化钠防腐，小量分装如0.1~1ml，真空干燥后更易长期保存。
