恩诺沙星和环丙沙星残留检验的高效液相色谱法

2019.12.13

(1)试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GB／T6682规定的二级水。

①环丙沙星含环丙沙星不得少于99．0％

②恩诺沙星含环丙沙星不得少于99．0％

③乙腈：色谱纯

④三乙胺

⑤氢氧化钠

⑥磷酸二氢钾

⑦磷酸

⑧5．0mot儿氢氧化钠溶液：取氢氧化钠饱和溶液14ml，加水稀释到100ml；

⑨0．03mot／L氢氧化钠溶液：取5．0mol／L氢氧化钠溶液o．6ml，加水稀释到100ml。

⑩0．05mol／L磷酸／三乙胺溶液(pH 2．4)：取85％的磷酸3．4ml，加水稀释到1000ml，搅拌下滴加三乙胺，调pH值至2．4。

⑾磷酸盐缓冲液(用于肌肉、脂肪组织)：取磷酸氢钾6，88，加水溶解并稀释至500ral，用lOmol儿氢氧化钠溶液调pH值至7.0。

⑿磷酸盐缓冲液(用于肝脏、肾脏组织)：取磷酸氢钾&8g，加水溶解并稀释至600ml，调pH值为4．0～5．O。

⒀环丙沙星、恩诺沙星标准贮备液：称取环丙沙星、恩诺沙星对照晶各50mg，用o．03mol／L氢氧化钠溶液溶解并稀释成浓度为lmg／mI的贮备液，置2～8℃冰箱中保存，有效期为1个月。

⒁环丙沙星、恩诺沙星标准工作液：准确量取适量环丙沙星、恩诺沙星标准贮备液，用乙腈稀释成适宜浓度的环丙沙星、恩诺沙星标准工作液。

(2)仪器和设备

①高效液相色谱仪(配荧光检测器)

②分析天平感量0．0001g

③天平感量O．01g

④涡旋振荡混合器

⑤组织匀浆器

⑥离心管 25m1、

⑦固相萃取装置

⑧离心机

⑨C18固相萃取柱

(3)测定步骤

①提取称取(2i 0．05)z试料，置于30ml匀浆杯中，加磷酸盐缓冲液10．0ml，1]0000r／min匀浆llnin。匀浆液转入50ml离心管中，振荡混合5min，4000r／min离心10rain，上清液转入另一25ml离心管中。用磷酸盐缓冲液10．0mi洗刀头及匀浆杯，转入50ml离心管洗残渣，搅匀，振荡，离心。合并上清液于25ml离心管中，备用。

②净化 Cis固相萃取柱依次用2ml甲醇、2ml润洗，润洗完毕后，准确量取适量备用液过柱，用2ml水洗，挤干。加2．0ml流动相洗脱，挤干。收集洗脱液作为试样溶液，供高效液相色谱分析。

③标准曲线的制备准确量取适量环丙沙星、恩诺沙星标准工作液，用流动相稀释成浓度为0．002ug／ml，0．005ug／m1，0．01ug／ml，0．05ug／m1，0．10ug／m1，O．30ug／ml，0.50ug／ml的环丙沙星、恩诺沙星标准溶液，供高效液相色谱分析。

④测定

a.色谱条件

色谱柱：C18 250mm×4．6mm(内径)，粒径5／tm，或相当者。

流动相：0．05mol／L磷酸溶液／三乙胺—乙腈(82+18)

流速：0．8mi／mid。

检测波长：激发波长280nm；发射波长450nm

进样量：20uL。

b.测定取适量试样溶液和相应的标准工作溶液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及式样液中的环丙沙星、恩诺沙星响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，环丙沙星、恩诺沙星的保留时间分别在11min和8min左右。

⑤空白试验取空白试料，采用完全相同的测定步骤进行平行操作

(4)灵敏度和回收率