细胞的冻存和复苏
细胞冻存和复苏
细胞冻存后可保存种子细胞，以便随时取用；减少细胞被微生物污染的危险性；减少细胞之间交叉污染的危险性；减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变；避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。冻存细胞前，应对细胞进行鉴定并检查是否被污染。
细胞冻存及复苏的基本原则是“慢冻快融”，这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多用甘油或二甲基亚砜（DMSO）作为保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性；缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的物理损伤。复苏细胞采用快速融化的方法可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。需要特别注意的是DMSO 稀释时会释放大量热量，因此DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。
细胞冻存
细胞冻存前12-24h，换新鲜培养基，使细胞一直处于对数生长期。
待细胞长至80%汇合时胰酶消化，用新鲜培养基吹打后制成细胞悬液，1000rpm离心10min。悬浮细胞则直接离心。
弃上清，加入冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为3×10^6-1×10^7cells/mL。将细胞悬液分至冻存管内，每管1-1.5mL，拧紧盖子。在管壁上做好标记，标明细胞名称、冻存日期等。
按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃过夜→液氮保存。也可使用程序降温盒更为方便，细胞冻存管放入程序降温盒内可直接放入-80℃过夜，再转至液氮罐内。注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于最低刻度线；冻存5次后异丙醇需要更换一次，以免影响冻存效果。
细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存。
细胞复苏
冻存细胞十分脆弱，必须轻柔操作。除少数对冷冻保护剂（DMSO或甘油）敏感的细胞，绝大部分细胞在解冻之后，可直接接种到完全培养基中，隔天再换新鲜培养基以去除DMSO 和死细胞，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴壁的问题，也可因不离心，减少了操作步骤，降低污染的几率。
将冻存细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中快速解冻，轻轻晃动冻存管，使细胞能在1-2min内完全解冻，尽快通过最易受损的温度段（-5-0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，避免引起污染。
用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至装有完全培养基的离心管内制成细胞悬液。进行活细胞计数，调整细胞浓度至少为3×10^5个活细胞/mL。
将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。
第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除DMSO和死细胞。继续培养，待细胞长至80-90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2-3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。
来源：武汉普诺赛生命科技有限公司
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