酶法生产L-酪氨酸的方法介绍
酶法也称为微生物转化法，主要是利用微生物细胞内酪氨酸酚裂解酶（tyrosine phenol-lyase，TPL，EC 4.1.99.2）将苯酚、丙酮酸和氨或者苯酚、L-丝氨酸转化为L-酪氨酸。研究较多的、具有较高酶活的TPL主要来自于微生物草生欧文氏菌（Erwinia herbicola）、中间柠檬酸菌（Citrobacter intermedius）、弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii）以及嗜热菌（Symbiobacterium toebii）等。Genex公司的Lee和Hsiao于1986年最早利用产气克雷伯氏菌（Klebsiellaaerogenes）丝氨酸羟甲基转移酶和Erwinia herbicola ATCC 21434酪氨酸酚裂解酶，将以甘氨酸为底物合成L-丝氨酸的反应和以L-丝氨酸为底物合成L-酪氨酸的反应相偶联。在500mL反应体系中加入0.32%苯酚、0.25 M 甘氨酸、0.5 mM 5-磷酸吡哆醛、0.056 M β-巯基乙醇、1.7 mM 四氢叶酸。在pH为7.0、37℃条件下以37%甲醛启动反应，16 h后可产生L-酪氨酸26.3 g/L，甘氨酸转化率达到61.4%。但该工艺稳定性较差而且甘氨酸对TPL活性有很强的抑制作用。考虑反应过程中酶活性和稳定性差等缺点，近年来利用DNA改组技术提高TPL稳定性也受到关注。韩国KRIBB的Eugene等人通过对Symbiobacteriumtoebii中的TPL进行随机突变筛选和交错延伸DNA shuffling得到了催化活性提高三倍，同时半失活温度提高了11.2 ℃的AS6突变体。测序结果显示在催化活性区域其存在T129I或者T451A突变，而包含A13V，E83K和T407A在内的三个突变则对提高热稳定性有极大帮助。而此课题组的Kim等人在E. coliBL21(DE3)中过表达此催化活性和热稳定提高的TPL，并制备成催化粗提液。在2.5 L的流加式反应器系统中通过分批补加2.2 M的苯酚、2.4 M的丙酮酸钠、0.4 mM 5-磷酸吡哆醛和4 M的氯化铵并在反应罐上方充满氮气以降低底物的氧化作用，40 ℃反应30 h后可积累130 g/L的L-酪氨酸，苯酚的转化率最高可达94%。
