PCR-SSCP 技术实验
聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技术可用于：（1）癌基因和抑癌基因突变的筛查检测；（2）遗传病的致病基因分析；（3）基因诊断，基因制图等领域。
| 实验方法原理 | PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的 DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | Taq DNA聚合酶PCR反应缓冲液引物dNTPs丙烯酰胺TBE缓冲液过硫酸铵TEMED甲酰胺上样缓冲液固定液银染液显色液 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、PCR反应 20 ml反应体系成分如下： 模板DNA（100 ng/ml） 1 ml 10×PCR反应缓冲液 2 ml Taq DNA聚合酶（5 U/ml） 0.2 ml 4×dNTPs（2.5 mmol/L） 1 ml MTHFR上下游引物 各 1 ml ddH2O 加至终体积 20 ml PCR反应循环参数： 95℃ 5 min； 94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s，共30个循环； 72℃ 7 min。 反应结束后，置4℃保存。 二、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 制备6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶：30%聚丙烯酰胺（交联度49:1）10 ml，5×TBE缓冲液10 ml，加蒸馏水至50 ml，加TEMED 25 ml、10%过硫酸铵250 ml，混匀后灌胶，插入加样梳子。待胶完全聚合后，拔出加样梳子，安装电泳装置，加入电泳缓冲液（1×TBE），缓冲液应高于加样孔上缘，用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。 2. 取5 ml 扩增产物加10 ml变性上样缓冲液混匀，98℃变性10 min，迅速冰浴。 3. 取5 ml混合液加到点样孔中，以1——8 V/cm电泳4——5 h。 三、聚丙烯酰胺凝胶染色 1. 拆下电泳装置，取出聚丙烯酰胺凝胶，放到一个塑料盘内，用蒸馏水冲洗1——2遍。 2. 倒入固定液，固定8——10 min。 3. 用蒸馏水冲洗1——2遍；倒入银染液，银染10——12 min。 4. 用蒸馏水冲洗若干遍；倒入显色液，显色至出现清晰的银染带。 5. 用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶，观察PCR-SSCP结果。 四、结果判断 观察并记录聚丙烯酰胺凝胶上的DNA单链带，根据异常泳动变位筛查突变样本。 |
| 注意事项 | 1. 靶DNA序列长度不宜过长，否则灵敏度下降。 2. DNA样品在电场中泳动的长度一般要求在16——18 cm以上。 3. 染色最好在塑料盘中进行。 4. 环境温度越高，聚丙烯酰胺凝胶越易凝固。应根据环境温度的变化调整 凝胶中10％过硫酸铵与TEMED的用量。 5. 电泳过程中应保持恒温，最好使用薄的凝胶和冷却系统以散发热量。 6. 用AgNO3染色时，染色时间需随环境温度变化作适当调整，环境温度越 低，所需的染色时间越长。 7. 显色时间不可过长，以免背景过深影响结果观察。 |
