动物来源产品中兽药残留的筛查
目的
为动物来源性产品中150多种兽药残留的筛查提供一种有效的解决方案。
前言
兽药广泛的应用于治疗或预防动物疾病，但会带来肉、鱼、奶、蛋和蜂蜜等动物性产品中的痕量药物残留。由于对人体健康存在潜在的危害，食品链中药物残留的存在也引起了广泛的关注。确实，污染的动物产品可能导致过敏反应或由于细菌抵抗的发展导致临床治疗上间接的问题。为了保护消费者的健康并确保动物性产品的质量，在世界范围内设立了动物产品中药物允许的最高含量，即最大残留量（MRLs）1-3.
传统上，生物材料中兽药残留由微生物和免疫组化技术进行分析4。而这些方法可以为特定类别的化合物提供一种快速经济的筛查方法，每种测试盒一般仅对一种化合物有效，对模糊物质的鉴定缺乏选择性，且结果仅近似定量。至于阳性结果，政府法规部门通常要求更加精确的色谱分析方法以确定抗生素的存在及含量。
由于MRLs相关法规变得更加严格，发展定量方法以及确认和鉴定技术以使假阳性结果最小化就更为重要。飞行时间质谱法（TOF MS）筛查具有一定的优势，如历史数据追踪、简化仪器方法设定和在增加化合物数量时方法的效果无需折衷，因而受到广泛欢迎。然而，处理和检查TOF筛查数据通常包含一个复杂的工作流程，当阳性峰首次确定后，随后对消费者风险进行定量。定性向定量过程的转化通常是手工完成的，它设置了一个明显的数据检查资源渠道及较高的误差率。
该应用实例描述了Waters® 的ACQUITY UPLC®及四级杆飞行时间Xevo™ QTof质谱用于超过150种兽药残留及代谢物，包括阿凡曼菌素、苯咪唑类、β-激动剂、β-内酰胺类、皮质类固醇、大环内酯类、硝基咪唑类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类和其它兽药产品的定点筛查。ACQUITY UPLC 分离分析速度较快，同时保持高效率和分离度。ACQUITY UPLC与Xevo QTof质谱相结合，以便保持高灵敏度的分离效率、检测的选择性和准确质量。数据采用POSI±IVE™ 软件处理，使得准确质量数据可在一个简单通道中进行定性和定量，对阳性检测物质则直接得出重要的定量结果。
实验
样品制备
此前曾有报道描述了牛奶的样品准备方法4。对于肝脏、血、鱼和肉样品，采用5g样品与20 mL乙腈和5 g 无水Na2SO4。离心后，在4ml上清液中加入0.4 mLDMSO。挥干乙腈，样品加入0.8g水配成原来浓度，进样前离心。附录1列举了筛查的兽药残留物质。
UPLC条件
LC 系统： ACQUITY UPLC
色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C18
1.7 μm, 2.1 x 100 mm
柱温： 40˚C
流动相A： 0.1% 甲酸 （无水）
流动相B： 乙腈 + 0.1% 甲酸
梯度： 时间 (min) %A
0.00 95
0.25 95
6.00 5
7.00 5
7.20 95
9.00 95
流速： 0.40 mL/min
进样量： 20 μL 满定量环
MS条件
MS系统： XEVO QTof MS
采集模式： MSE
离子模式： ESI正
毛细管压： 2.4 kV
锥孔电压： 30 V
MS 碰撞能量： 6 V
MSE 碰撞能量范围： 25 to 35 V
离子源温度： 120 ℃
脱溶剂化温度： 400 ℃
脱溶剂化气体流速： 800 L/hr
锥孔气流： 20 L/hr
采集范围： m/z 50 to 1000 for 0.1 s
Xevo QTof质谱（采用甲酸钠和锁定质量检测进行质量校准）采用IntelliStart™ 软件进行自动设置。
数据获得及处理
数据采用Waters MassLynx™ 4.1版本获得，采用POSI±IVE 软件处理。在MSE采集模式下，数据一直通过两个通道进行收集：低碰撞能量（CE）用于分子离子信息；及高CE 用于子离子。图1显示了TOF筛选工作流。
图 1. TOF筛查工作流程，自样品准备至数据分析的理论步骤，包含确保该流程无缝运行所整合的仪器和软件
结果和讨论
对复杂材料的选择性来源于ACQUITY UPLC的高色谱分离度和Xevo QTof质谱的高质谱分离率及其在较窄质量窗内重现质谱图的能力。图2显示了牛肝脏提取物中达氟沙星的总离子流色谱图（TIC）及其对应的精确质谱图， 并以此为例。
图2. 牛肝脏中达氟沙星的总离子流色谱图（TIC）及其相应的质朴图
高分离度对获得结果的选择性和提升可信性非常有帮助。然而，在一些情况下，额外的信息，如子离子，将可能对待检的不确定化合物产生显著的益处。图3显示了赛拉嗪和莫仑太尔监测结果中增加的可信性，两种物质精确质量（m/z 221.1112）和元素组成（C12H16N2S）相同，保留时间相似（2.44和2.52 min）。赛拉嗪和莫仑太尔子离子相同（m/z 164.0536），但可由指定的唯一的子离子（m/z 90.0366和150.0381）进行鉴定。非常高的质谱分辨率将无法分离这些物质，因此结构信息对待检残留的模糊鉴定非常重要。
图 3. 对相同精确质量相同的残基进行清晰的鉴定, MSE下赛拉嗪（2.44 min）和莫仑太尔（2.52 min）
子离子信息可通过进行源内裂解，MS/MS或MSE获得：
源内裂解是一种直接获得产品离子的方式，但与MS模式相比灵敏度较低，且由于离子源条件随着流动相和基质的改变难于控制。
MS/MS是一种基于数字的技术，它可以提供高质量的子离子谱，但工作周期较低，高丰度残留时产生偏移，且必须在预先知道样品的成分的情况下使用。
MSE是一种ZL的基于数字的技术，可提供简单、无偏移、平行的途径，传递每个可检测成分的准确质量分子（MS）及子离子（MSE）信息，无需多次进样。
这些信息仅在子离子可于基质中相应水平被检测到时有效。图4显示了牛血提取物中磺胺多辛在MSE模式下低碰撞能和高碰撞能质谱图，证明了子离子可在基质中相应水平上被检测。
图4. 牛血中磺胺多辛在低CE 和高CE下的MSE模式质谱图，显示子离子可在基质中的相关水平上可检测。
图5 显示了低CE和高CE在MSE模式下获得的光谱的差异，低CE谱由分子离子主导，而高CE谱包含子离子，这增加了鉴定的可信性。
图 5.牛血中磺胺多辛在低CE和高CE中MSE模式谱图
分析样品以便获得9min的总循环时间（包括平衡时间）。这使得每天实际样品处理量超过100种样品。然而，这种样品处理量以及每种样品150种残留物给数据处理和运算带来了明显的问题。
POSI±IVE软件是专为降低检查TOF质谱筛选数据的数据运算时间而研发的，确保仅有阳性（准确质量和保留时间在预定的偏差内）及暂时的（保留时间尚可，但标识为准确质量超限）检测将自动定量。仅需要一张包含化合物名称、结构式和保留时间的目标化合物列表A，而这一列表的长度不受限制。
在自动运算过程中，POSI±IVE软件执行定性搜索，采用质量准确度和保留时间决定化合物是否为阳性、暂时或未检出，以生成目标列表中化合物存在/不存在的信息。所有阳性和暂时检测随后被自动定量，并采用TargetLynx 浏览器报告，含有同位素组成（iFit™）检测的方式列出。图6显示了牛血提取物POSI±IVE Xevo QTof质谱筛查结果，超过150种兽药中仅定性及定量检测出3种：氢化可的松、磺胺多辛和甲氧苄啶。受试样品中显示出血样中甲氧苄啶阳性鉴定和定量结果。
由于其不包括在运算方法内，氢化可的松在原始定向分析中未有报告。POSI±IVE 半定向方式的优势之一是残留物列表的长度没有限制，且无强制性校准标准。记录的数据档案将被新的信息重新运算，氢化可的松随后即被检测并在原始数据档案中量化。
图 7.牛血POSI±IVE Xevo QTof MS筛查报告表明存在3种残留物
图7牛血提取物生成报告中的一部分，其中150中残留物范围被缩小至3种经保留时间，精确分子量和iFIT鉴定为阳性。
结论
由于其对人体健康存在潜在危害，食品链中兽药残留的存在受到广泛关注。
ACQUITY UPLC和Xevo QTof 质谱方案简化了动物源性产品中超过150种兽药残留物在适当的 MRLs下的筛查。
在对待检残留物指定鉴定时，MSE信息增加了额外的可信性，并克服了常规数据依赖性途径的局限性。
TOF MS数据信息丰富的特性增加了其对数据处理软件的要求，因此降低手工处理并自动重复性任务对提高结果的质量和TOF MS的接受性非常必要。
POSI±IVE通过确保仅有阳性和暂时的检测可被自动定量，显著降低检查TOF质谱筛查数据处理的瓶颈。自动处理的性质通过在工作流程中除去了人工转录步骤，而降低了发生错误的可能性。
参考文献
附录1：
| 甲泼尼龙 阿苯达唑 阿苯达唑砜 阿苯达唑亚砜 阿莫西林 氨苄西林 阿奇霉素 苯佐卡因 倍他米松 溴布特罗 溴己新 卡拉洛尔 卡巴多司 羧苄西林 头孢克洛 头孢羟氨苄 头孢氨苄 头孢洛宁 头孢孟多 头孢唑林 头孢哌酮 头孢噻肟 头孢西丁 硫酸头孢喹肟 头孢磺啶 头孢噻呋 头孢曲松 头孢呋辛 头孢乙腈 头孢噻吩 头孢匹林 头孢拉定 金霉素 塞布特罗 西诺沙星 环丙沙星 | 克仑特罗 克伦普罗 氯吡多 氯唑西林 环苯达唑 达氟沙星 氨苯砜 去甲金霉素 地塞米松 二氨藜芦啶 双氯西林 乙胺嗪 二氟沙星 二甲硝唑 羚基二硝基咪唑 脱氧土霉素 依诺沙星 恩氟沙星 红霉素 非班太尔 芬苯达唑 芬苯达唑砜 氟罗沙星 氟苯达唑 氟苯咪唑 氟甲喹 氟甲喹 氢化可的松 异丙硝唑 羟基异丙硝唑 交沙霉素 酮洛芬 柱晶白霉素 A1 左旋咪唑 左旋咪唑 洛美沙星 | 马波沙星 甲苯达唑 5-羟基甲苯咪唑 2-氨基-5-苯甲酰苯并咪唑 美洛昔康 甲硝唑 羟基甲硝唑 盐酸米诺环素 莫仑太尔 莫仑太尔 萘啶酸 萘啶酸 那他霉素 诺氟沙星 新生霉素 氧氟沙星 奥喹多司 磷酸竹桃霉素 苯唑西林 奥芬达唑 奥苯达唑 奥索利酸 盐酸土霉素 培氟沙星 青霉素G 青霉素v 吡喹酮 泼尼松龙 泼尼松龙 异丙嗪 乙胺嘧啶 噻嘧啶 利福昔明 罗硝唑 罗沙胂 罗红霉素 | 舒喘灵 沙氟沙星 螺旋霉素-l 磺胺苯酰 磺胺醋酰 磺胺氯吡嗪钠 磺胺氯达嗪 磺胺嘧啶 磺胺地索辛 磺胺多辛 磺胺噻唑 磺胺脒 磺胺甲嘧啶 磺胺甲氧嘧啶 磺胺二甲嘧啶 磺胺二甲嘧啶 磺胺甲噁唑 磺胺甲噁唑 磺胺间甲氧嘧啶 磺胺噁唑 磺胺硝苯 磺胺吡啶 磺胺喹恶啉 磺胺噻唑 磺胺曲沙唑 磺胺索嘧啶 磺胺异恶唑 特硝唑 四环素 四米唑 噻苯哒唑 5-羟基噻苯哒唑 硫姆林 硫姆林 替米考星 甲苯磺丁脲 | 托芬那酸 三氯苯达唑 三氯苯达唑砜 三氯苯达唑亚砜 三氟丙嗪 甲氧苄啶 三乙酰竹桃霉素 妥洛特罗 泰洛星 维及霉素M1 赛拉嗪 折仑诺 |
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