多肽硫酯蛋白合成新技术
伦敦大学Macmillan研究组对采用化学配体技术合成经修饰改变的肽和蛋白感兴趣。蛋白合成和半合成——由合成和重组来源制备的多肽片段——对生产治疗性蛋白和理解转录后主导修饰的机制很重要。
理解该过程很困难，因为它们不是按模板工作，也不直接受遗传控制。Macmillan组研究采用有机合成化学、分子生物学、蛋白表达、蛋白工程来研究转录后的修饰改变。
尤其是，Macmillan研究组发现了NCL关键试剂多肽硫酯的新过程：多肽硫酯能从末端为Xaa-Cys序列的天然多肽中制备得到（其序列中Xaa 为Gly、His或者 Cys ）(图1, Ref 1A)。该反应产生的硫酯已经应用于合成具有生物活性的人β-defensin 3 (Ref 1B)类似物和人Hepcidin。最近已经证实它们同O- and N- 糖肽合成 (Ref 2)和磷酸化蛋白半合成相容。
图1 通过N→S酰基转换形成硫酯。典型反应条件：10% v/v MESNa; 0.1 M Na phosphate buffer, pH 5.8; 0.5% v/v TCEP, 55°C, 48 h。(MESNa = sodium 2-mercaptoethanesulfonate，巯乙磺酸钠, TCEP = tris-carboxyethylphosphine，tris-羧基乙膦)。
为了更好地理解反应， 研究发现增加相对少量过量的cysteine能逆转硫酯的形成(Ref 2)，表明硫酯形成和NCL能在相同反应条件下发生。 为了使NCL反应有效率提高，需要增加高浓度半胱氨酸。 但是在分子内NCL反应情况下(图 2)，半胱氨酸有效浓度高时能直接形成环状多肽产物(图 2C)，而无需采用任何特异性连接剂或蛋白处理成分，例如内含肽(Ref 3)。
图2 从简单的线性前体形成头尾相接的环形肽。典型反应条件：10% v/v MESNa; 0.1 M Na phosphate buffer, pH 5.8; 0.5% v/v TCEP, 55°C, 48 h。 (注意: 环化反应中可用TCEP替代抗坏血酸钠（sodium ascorbate）。)
Macmillan研究组发现当反应在pH 2时进行，产生的硫酯为主。但是，当pH 5-6时，无需优化就能分离得到环形肽（产率为40-60%）。这是一个连续的过程，C端单一的氨基键选择性地断裂，同时新的氨基键在缺少酶的情况下不使用化学偶联剂在水中形成。已发现，所制备的源于β-defensins的环形肽片段保留有抗微生物活性，其镜像异构体呈现出对血清中蛋白溶解的对抗性增高。
Macmillan研究组把连续进行的研究重点放在理解如何改进环形肽的形成。在此过程中，通过天然肽序列中N→S酰基转移实现了首例无内含肽的氨基键的重新排列。 此方法应该可应用于各种环形肽的形成。将来研究工作主要在制备各种天然生成的环形肽和来自生物源性的线性前体的蛋白。
Derek Macmillan 博士为伦敦大学(UCL)有机化学副教授。2005年从爱丁堡大学转到伦敦大学，成为皇家大学研究人员协会会员。此前，Macmillan博士获得爱丁堡大学的硕士和博士学位。1999-2001年在美国加州大学Berkeley分校Carolyn Bertozzi博士实验室从事博士后研究。在博士后研究期间，Macmillan博士开始对应用天然化学配体进行糖蛋白半合成发生兴趣。Macmillan博士意识到治疗性药物需要有糖蛋白，但是仅仅通过生物合成方法不能满足对糖蛋白的需求。因此，他的研究组致力于开发有效途径，以可控方式把聚糖和寡糖模拟体掺入到合成的和源于细菌的多肽中。在糖蛋白方面永生的工作，他们继续与DexTra Laboratories公司合作。
Macmillan研究组最近的研究方向在开发多肽和蛋白中新的N→S酰基转移反应，直接利用肽的硫酯为蛋白的合成和半合成提供关键的工具(Ref 1-3)。
参考文献
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