SsrB对伤寒沙门菌氧应激早期基因表达的调节
【摘要】 目的： 研究伤寒沙门菌ssrB基因在氧应激早期对其他基因表达的调节。方法： 通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和ssrB基因缺陷变异株在氧应激早期的基因表达差异，并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证;利用HeLa细胞进行侵袭实验，研究ssrB基因对伤寒沙门菌侵袭能力的影响。结果： 成功制备伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株;基因芯片结果分析显示，在氧应激早期，与野生株相比，伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株有68个基因表达下调，有20个基因表达上调，其中与侵袭相关的基因表达下调。实时定量PCR与芯片结果一致。ssrB基因缺陷变异株侵袭上皮细胞的能力仅为野生株的34.6%。结论： SsrB在伤寒沙门菌氧应激早期对基因表达起重要调节作用，并且能够增强伤寒沙门菌侵袭上皮细胞的能力。
【关键词】 伤寒沙门菌; ssrB; 氧应激; 基因芯片; 侵袭
[Abstract] Objective: To investigate the regulation of ssrB on gene expression of Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) at earlystage of oxidative stress. Methods: The ssrB deleted mutant of S. Typhi was generated through homologous recombination mediated by suicide plasmid; the gene expression profiles of the wildtype strain and the ssrB deleted mutant at earlystage of oxidative stress was investigated by genomic microarray assay; qRTPCR was performed to further validate the results of microarray assay. The HeLa cells were invaded by S. Typhi to explore the influence of ssrB on invasion of epithelial cells. Results: The ssrB deleted mutant of S. Typhi was prepared successfully;analysis of genomic assay showed that， compared to the wildtype strain， 68 genes were upregulated and 20 genes were downregulated in the ssrB deleted mutant at early stage of oxidative stress. The results of qRTPCR assay were consistent with the results of microarray assay. The ability of the ssrB deleted mutant to invade the epithelial cells was only 34.6% of the wildtype strain. Conclusion: SsrB of S. Typhi play an important role in regulating gene expression at early stage of oxidative stress and enhanced the ability of S. Typhi to invade epithelial cells.
[Key words] Salmonella enterica serovar Typhi; ssrB; oxidative stress; gene microarray; invasion
伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S. Typhi)是一种经消化道感染后可引起全身系统性感染的重要的人类致病菌[1]。伤寒沙门菌在从外界环境进入宿主环境的过程中需要面对一系列不利条件，适应不断变化的宿主环境， 例如，从酸应激到碱应激，从高渗应激到低渗应激以及多种形式的氧应激和大量的抗菌肽应激[2]。宿主细胞内的活性氧，如超氧化物和过氧化氢可以破坏细菌的DNA、蛋白质和细胞膜从而抵御细菌的入侵[3]。应对细胞内的氧应激环境对伤寒沙门菌成功感染宿主具有重要意义[4-5]。
伤寒沙门菌需要及时感应宿主环境中的各种信号分子，精细地调控自身毒力基因的表达。SsrAB双组分调控系统是伤寒沙门菌中与调节毒力基因相关的系统，编码该系统的ssrA、ssrB基因位于伤寒沙门菌致病岛-2(SPI2)上。其中ssrA是感应蛋白，属于胞质—细胞膜感应蛋白BvgS家族[6];SsrB为调节蛋白，具有一个接收域和一个螺旋—转角—螺旋DNA结合域[7]。已有研究证实，在鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium，S. Typhimurium) 中，在低镁和酸应激的条件下，ssrB可调控多个毒力基因的表达。伤寒沙门菌与鼠伤寒沙门菌具有较高的同源性，在伤寒沙门菌中，在氧应激条件下ssrB是否参与基因表达调节是个值得关注的问题。本研究拟通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌ssrB基因缺陷株，并通过基因组芯片技术比较野生株和缺陷株的基因表达差异，研究ssrB基因在氧应激条件下对其他基因表达的调节。1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 菌株、质粒和细胞株
伤寒沙门菌野生株GIFU10007，大肠埃希菌SY372λpir和自杀质粒pGMB151由日本岐阜大学医学院学教研室馈赠;大肠埃希菌DH5α由本室保存;pGMET载体为Promega产品;HeLa细胞由江苏大学基础医学与医学技术学院教研室馈赠。
1.1.2 主要试剂与材料
rTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶BamH I和Sal I、T4 DNA连接酶、RNase H、DL2000、Xgal、实时定量PCR试剂盒均为TaKaRa(大连)公司产品;IPTG为Sigma公司产品;胰蛋白胨和酵母提取物为Oxoid公司产品;RIPM1640和小牛血清为Sigma公司产品;TA克隆试剂盒、胶回收试剂盒为Promega公司产品;质粒提取试剂盒为Axygen公司产品;RNA提取试剂盒和cDNA纯化试剂盒为Qiagen公司产品;逆转录试剂盒为Invitrogen公司产品;荧光染料为Amersham Pharmacia Biotech AB公司产品;沙门菌基因组DNA芯片由本室制备保存。
1.1.3 主要
PCR仪(Eppendorf);凝胶成像分析系统(Syngene);高速冷冻(Eppendorf)， 电转化仪(BioRad);核酸检测仪 (NanoDrop);基因芯片扫描分析系统4100B (Axon);荧光定量PCR仪(Corbett);CO2细胞培养箱(Binder)。
1.2 方 法
1.2.1 引物设计
根据本室测定的伤寒沙门菌野生株GIFU10007基因组序列(未公布)设计引物，采用的软件为Oligo 6.0。制备缺陷株的引物设计：根据GIFU10007基因组序列显示，ssrB基因全长639 bp。根据ssrB基因及其上、下游序列设计两对特异性PCR引物P1A/P1B、P2A/P2B。在ssrB基因上游-366设计特异性PCR引物P1A，在P1A的5′端加BamH Ⅰ酶切位点，在ssrB基因204处设计特异性PCR引物P1B，在P1B 5′端加Sal Ⅰ酶切位点;在ssrB基因474处设计特异性PCR引物P2A，在P2A 5′端加Sal Ⅰ酶切位点，在ssrB基因下游821处设计特异性PCR引物P2B，在P2B的5′端加BamH Ⅰ酶切位点(图1)。以伤寒沙门菌GIFU10007为模板，扩增出570 bp同源性上游片段F1和同源性347 bp下游片段F2，通过Sal Ⅰ酶切F1和F2片段可定向连接为F1-F2片段，通过BamH Ⅰ酶切F1-F2片段可克隆至自杀质粒，同源重组后可获得中间缺失270 bp的ssrB基因缺陷株。qRTPCR引物设计：根据伤寒沙门菌GIFU10007基因组中的orgA， prgK， prgH基因序列，分别设计一段特异性引物，通过检测荧光值来观察该基因的表达情况。以上引物由上海生工生物技术服务有限公司合成，序列见表1。表1 引物序列图1 制备伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株的引物设计
1.2.2 制备伤寒沙门菌ssrB缺陷株
伤寒沙门菌ssrB缺陷株制备主要参考文献[8]进行。以伤寒沙门菌野生株GIFU10007的基因组DNA为模板，用特异性引物P1A/P1B扩增ssrB基因上游同源片段F1，用P2A/P2B扩增ssrB基因下游片段F2，纯化后的F1， F2用Sal Ⅰ酶切，酶切后的F1， F2在T4 DNA连接酶的作用下定向连接成F1-F2片段。用胶回收试剂盒回收F1-F2片段与pGMET载体连接，热击法导入大肠埃希菌DH5α进行TA克隆。对阳性克隆质粒先用PCR和BamH Ⅰ酶切初步鉴定，再用DNA测序(上海生工生物技术服务有限公司完成)最后鉴定。用BamH Ⅰ酶切阳性重组质粒并用胶回收得到带有BamH Ⅰ酶切口的目的片段F1-F2，同时用BamH Ⅰ酶切自杀质粒，通过T4 DNA连接酶将F1-F2连接至自杀质粒，用热击法导入大肠埃希菌SY372λpir，对重组自杀质粒经PCR和BamH Ⅰ酶切鉴定。将带有目的片段F1-F2的阳性自杀质粒用电击法导入伤寒沙门菌野生株GIFU10007，在含有5%蔗糖的LB平板上培养，诱导同源重组。将连续4次传代，PCR均只扩增出缺失270 bp的小片段的菌株定义为稳定的已完全重组的伤寒沙门菌ssrB基因缺陷株。1.2.3 总RNA提取
分别挑取伤寒沙门菌野生株和ssrB缺陷株单菌落于1 ml等渗LB液体培养基中培养(37 ℃，250 r/min)过夜后，以1∶100分别转接于20 ml等渗LB液体培养基中培养(37 ℃，250 r/min，3 h)至对数生长期后，向LB培养液中加入4 mmol/L H2O2进行氧应激15 min，置于冰上冷却10 min，离心(4 000 r/min，4 ℃，10 min)，弃上清，收集菌体。用TE缓冲液洗菌体1次，离心(4 000 r/min，4 ℃，5 min)，收集菌体。用RNA提取试剂盒提取细菌总RNA后，用无RNA酶的DNase I消化(37 ℃ 15 min，80 ℃ 15 min)残量DNA。用核酸检测仪测定RNA浓度(如后续进行芯片分析，要求RNA总量大于50 μg)，同时取少量RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量(要求RNA条带清晰，无残余DNA)。
1.2.4 RNA逆转录与cDNA荧光标记
RNA逆转录与cDNA荧光标记体系：RNA 20 μg， N9引物 3 μg，GDP引物[9-10] 3 μg，加无RNA酶的ddH2O至总体积14.5 μl，70 ℃预变性10 min后，再按说明书加入逆转录试剂盒中的5×缓冲液，RNA酶抑制剂，dNTPs， MDTT，逆转录酶，最后加入荧光素标记的Cy3或Cy5dCTP，总体积30 μl，逆转录的反应条件为25 ℃10 min，50 ℃4 h，85 ℃10 min。为了尽可能减小标记差异，对野生株和缺陷株cDNA的标记采用Cy3和Cy5配对互标。
1.2.5 基因芯片杂交、扫描及结果分析
基因芯片在正式杂交前4～6 h，在点样区加预杂交液进行活化。逆转录得到的cDNA产物经试剂盒纯化后，加入杂交液，混匀，95 ℃，避光，变性10 min。将准备好的杂交液加在基因芯片已活化的点样区，42 ℃，避光，杂交16 h。用芯片扫描仪扫描杂交后的芯片，得到的图像与数据用GenePix Pro6.0软件进行处理和分析。平行操作的两张互标的芯片可提供每个基因的4个数据，通过进一步的数据分析，最后定义表达差异1倍以上的基因作为在野生株与缺陷株中表达有差异的基因。基因芯片实验重复3次。
1.2.6 实时定量PCR(qRTPCR)
采用Takara公司的实时定量PCR试剂盒进行实验。反应体系：cDNA模板1 μl，待测基因的上下游引物各1 μl，试剂盒内含有PCR缓冲液、dNTP、Ex Taq DNA聚合酶和SYBR Green的混合物 17 μl。实验生物学重复3次，每次设平行对照组。得到的qRTPCR结果用Student′s t检验进行统计分析。
1.2.7 HeLa细胞的培养
使用含10%小牛血清的RIPM1640培养基，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养HeLa细胞，每2天传代1次。
1.2.8 伤寒沙门菌侵袭HeLa细胞
实验前1天，HeLa细胞以2×105/孔接种于24孔板。实验前1 h，以预热的PBS洗细胞3次，最后每孔加入新鲜的培养液1 ml。挑取伤寒沙门菌野生株和ssrB缺陷变异株单克隆分别接种于1 ml等渗LB培养液中，37 ℃振荡(250 r/min)培养过夜，实验前3 h，以1∶100的比例转接至新鲜LB培养基中至D(600 nm)值0.4(大约3×108cfu/ml)。将细菌以与细胞20∶1(MOI值)的比例加入到24孔板，37 ℃、5%CO2的培养箱中侵袭Hela细胞90 min，每孔以预热的PBS洗细胞3次后，或加入0.1% PBSDOC作用10 min破膜(T0)，收集从细胞中释放至破膜液中的细菌，涂平板，12 h后计数菌落数;或加入庆大霉素，终浓度100 μg/ml，37 ℃、5% CO2的培养箱中继续侵袭Hela细胞90 min(T90)，加入0.1%PBSDOC作用10 min破膜，收集从细胞中释放至破膜液中的细菌，涂平板，12 h后计数菌落数。以菌落数T90/T0的比值作为细菌侵袭能力的指标。实验生物学重复3次，每次设置平行对照组。结果用Student′s t检验进行统计分析。
2 结 果
2.1 伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株的制备
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PCR扩增得到的ssrB基因上游同源片段F1和下游同源片段F2经琼脂糖凝胶电泳检测，F1大约为570 bp， F2大约为347 bp，与预期相符。F1和F2片段经Sal Ⅰ酶切T4连接酶连接后进行TA克隆，对筛选到的阳性克隆进行DNA测序分析，结果显示F1-F2序列与缺失ssrB基因中270 bp的伤寒沙门菌野生株GIFU10007的原序列一致。将F1-F2片段成功克隆至自杀质粒后，提取带有目的片段的自杀质粒电转化导入野生株，使其在含有5%蔗糖的LB平板上与基因组DNA进行同源重组。经PCR鉴定，获得了连续4次传代均只扩增出缺失270 bp的小片段的菌株，即为稳定的完全重组的伤寒沙门菌ssrB基因缺陷株(图2)。 (a) PCR扩增F1、F2。M：DL2000 DNA 标准参照物;1：F1片段;2：F2 片段。(b) 重组自杀质粒鉴定。M： DL2000 DNA 标准参照物;1：PCR扩增F1- F2; 2：酶切重组自杀质粒。(c) 重组菌第4次传代后PCR观察结果。M： DL2000 DNA 标准参照物;1-8：PCR扩增重组菌F1- F2; 9： PCR扩增野生株F1- F2。图2 伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株的制备 2.2 伤寒沙门菌野生株和ssrB缺陷株氧应激早期基因表达的差异 将伤寒沙门菌野生株和ssrB基因缺陷株在等渗环境培养3h后，在培养基中加入H2O2进行氧应激， 15 min后，提取细菌总RNA，利用伤寒沙门菌全基因组芯片进行表达谱分析。芯片结果显示，与野生株相比，ssrB基因缺陷株有68个基因表达下调，有20个基因表达上调。 2.3 qRTPCR验证基因芯片分析结果 从芯片表达谱中选取orgA，prgK，prgH进行qRTPCR分析。结果显示orgA基因表达下调约10倍(t=115.2， P<0.001)，prgK基因表达下调约2倍(t=39.2， P<0.001)，prgH基因表达下调约1.5倍(t=55.8， P<0.001)。结果与芯片分析所得的表达差异基本一致，表明芯片分析结果可靠(图3)。图3 qRTPCR验证基因表达(n=9) 2.4 伤寒沙门菌野生株和ssrB基因缺陷变异株侵袭HeLa细胞能力差异 在基因芯片结果中下调的orgA、prgK和prgH基因均为伤寒沙门菌与侵袭相关的毒力基因，为了验证ssrB基因是否与伤寒沙门菌的侵袭性相关，选取了HeLa细胞进行伤寒沙门菌侵袭上皮细胞的体外实验。结果显示，ssrB基因缺陷变异株的侵袭能力仅为野生株的34.6%(t=228， P<0.001)，表明ssrB基因能促进伤寒沙门菌侵袭上皮细胞(图 4)。图4 伤寒沙门菌侵袭HeLa细胞的结果(n=6) 3 讨 论 目前研究表明，ssrAB双组分调控系统位于伤寒沙门菌SPI2上，可以调控SPI2以及位于SPI2以外的多个基因。ssrAB双组分调控系统也受多个上游调控因子的调控，例如，PhoPQ双组分调控系统，OmpREnvZ双组分调控系统以及SlyA， 其中OmpREnvZ双组分调控系统对SsrAB的调控是通过OmpR直接结合于ssrAB的启动子区域对ssrAB的转录进行调控[11-15]。这些研究结果提示，渗透压、酸碱度、镁浓度等多种环境因素可以影响ssrAB的表达，显示ssrAB对其下游基因的调控也有复杂的机制。 本组研究结果显示，与野生株相比，伤寒沙门菌ssrB基因缺陷株在氧应激早期共有88个基因表达发生变化，其中，表达量下调的基因有68个，表达量上调的基因有20个。我们选取了表达下调的orgA，prgK，prgH基因用qRTPCR进行验证，结果与芯片分析结果一致，进一步证明此次芯片结果可信。dcuA， dmsA， dmsB等是在缺氧条件下发挥作用的基因，芯片结果显示ssrB能负性调控这些基因的表达，提示ssrB在氧应激条件下能有效地调控基因，充分利用细胞内的资源应对氧应激。 伤寒沙门菌野生株和ssrB基因缺陷株侵袭HeLa细胞的体外实验显示，ssrB基因缺陷变异株的侵袭能力仅为野生株的34.6%，表明ssrB基因在伤寒沙门菌侵袭上皮细胞的过程中发挥重要作用，是伤寒沙门菌重要的毒力因子之一。 |
本文研究了伤寒沙门菌ssrB基因在氧应激早期对其他基因的调节，芯片分析结果显示ssrB可调控多个基因的表达，提示ssrB基因在伤寒沙门菌氧应激条件下发挥重要的调节作用，同时，侵袭HeLa细胞的实验结果显示，ssrB基因可以增强伤寒沙门菌的侵袭性。SsrAB双组分调控系统介导的与伤寒沙门菌侵袭相关的毒力基因表达下调是直接还是间接地通过调控其他基因来实现的尚需要更多的实验证据。SsrAB双组分调控系统响应氧应激的具体机制尚不清楚，需要进一步的研究。
【参考文献】略
作者：王敏1， 罗哲2， 杜鸿1， 孟彦辰1， 王菲1， 倪斌1， 徐顺高1， 黄新祥1 作者单位：(江苏大学1.基础医学与医学技术学院生物化学研究室; 2.生命科学研究院， 江苏 镇江 212013)
