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透化细胞和退化细胞器中测定比活性实验4

2019.4.04

测定[γ-32P]ATP的比活性

实验步骤	准备下列材料：含有未知浓度mp] ATP的细胞裂解物样品 10mg/ml激酶底物肽渐夜（Calbiochem) 0.5mraol/L cAMP 溶液 I、Calbiochem) cA-PrK (Calbiochem) cA-PrK分析缓冲液 lmol/L DTT储存液（^ 2〇尤保存） 0.5mol/LMg〇2 75mmol/L 正磷酸 Whatman P81确酸纤维素滤纸丙酮循环水浴旋涡混合器小心：强酸和强喊；IHT; MgCl2;丙酮（见附录5) 这_.使用的方法学在下-竹奋更详细的:叙述。CA-PrK分析的细f 4 分析缓冲液和底物的制备/K这里也会讲到2) 将一系列要进行试验的离心管贴上标签。将Wlmt_ P81滤纸切成1英寸的方块,与离心管对应地做上标记（PS1方块的制备见第29节)。 3) 将离心管放在冰上，加入下列成分 25^1含 [32P] ATP的裂解液 5fil l〇x分析缓冲液 l(il 0.5mmol/L cAMP 5W 10mg/ml激酶底物肽 1/zl lmol/L D1T l^tl 0,5ni〇l/L MgCl2 2^1水 4) 所有离心管都加好以后，盖上盖子，冰浴。 5) 每30秒加入1(^1 cA-PrK溶液，放入301水浴开始反应。按这样的时间安排进行实验可以经验件地确定合适的反映时间r 60、120, 180弓200分钟都要试一K,选定的时间应* 321>掺入激醻底物肽的平台期之后。 6) 从每管吸出3〇4到对应的P8]滤纸块表面D立即将滤纸放入含75mmoI/L正磷酸的烧杯。所有反应都如此处理过以后，冲洗P81滤纸5分钟。将磷酸溶液倒入装t 32P的废液的容器。再往烧杯中加入正磷酸，搅拌5分钟。如此冲洗P81滤纸5次。7) 往烧杯中加入丙酮，再冲洗5分钟u 倒掉肉酮，让四1滤纸在室温自然晾干：8) 将每一块P81滤纸放入20ml的液闪计数管，用液闪计数器测定放射性。展

实验步骤

准备下列材料：

含有未知浓度mp] ATP的细胞裂解物样品

10mg/ml激酶底物肽渐夜（Calbiochem)

0.5mraol/L cAMP 溶液 I、Calbiochem)

cA-PrK (Calbiochem)

cA-PrK分析缓冲液

lmol/L DTT储存液（^ 2〇尤保存）

0.5mol/LMg〇2

75mmol/L 正磷酸

Whatman P81确酸纤维素滤纸

丙酮

循环水浴

旋涡混合器

小心：强酸和强喊；IHT; MgCl2;丙酮（见附录5)

这_.使用的方法学在下-竹奋更详细的:叙述。CA-PrK分析的细f 4 分析缓冲液和底物的制备/K这里也会讲到2) 将一系列要进行试验的离心管贴上标签。将Wlmt_ P81滤纸切成1英寸的方块,与离心管对应地做上标记（PS1方块的制备见第29节)。

3) 将离心管放在冰上，加入下列成分

25^1含 [32P] ATP的裂解液

5fil l〇x分析缓冲液

l(il 0.5mmol/L cAMP

5W 10mg/ml激酶底物肽

1/zl lmol/L D1T

l^tl 0,5ni〇l/L MgCl2

2^1水

4) 所有离心管都加好以后，盖上盖子，冰浴。

5) 每30秒加入1(^1 cA-PrK溶液，放入301水浴开始反应。

按这样的时间安排进行实验可以经验件地确定合适的反映时间r 60、120, 180弓200分钟都要试一K,选定的时间应* 321>掺入激醻底物肽的平台期之后。

6) 从每管吸出3〇4到对应的P8]滤纸块表面D立即将滤纸放入含75mmoI/L正磷酸的烧杯。所有反应都如此处理过以后，冲洗P81滤纸5分钟。将磷酸溶液倒入装t 32P的废液的容器。再往烧杯中加入正磷酸，搅拌5分钟。如此冲洗P81滤纸5次。7) 往烧杯中加入丙酮，再冲洗5分钟u 倒掉肉酮，让四1滤纸在室温自然晾干：8) 将每一块P81滤纸放入20ml的液闪计数管，用液闪计数器测定放射性。