皮层／海马神经元的原代培养实验
基本方案
| 实验方法原理 |
神经元在发育过程中早于胶质细胞，因此通常选择胎鼠做脑内神经元培养。一般取El7-l8d孕大鼠或El4-16d孕小鼠做神经元培养。新生1d的仔鼠也可以用来培养神经元，但培养成功后杂细胞较多，有时需要进一步纯化。这两个部位的细胞培养方法类似 |
|---|---|
| 实验材料 | El7-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠 新生Id的仔鼠 |
| 试剂、试剂盒 | 含10%胎牛血清的DMEM培养基 神经元维持培养基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺） |
| 仪器、耗材 | 培养瓶 |
| 实验步骤 |
1.根据离心前细胞计数的结果，先用少量神经元维持培养基重悬细胞，充分重悬后，补加液体至合适体积，按照(2-4)x104/cm2的密度在培养板、玻片等介质上接种细胞，并置于37℃孵箱培养。 2.培养过程中接触细胞要注意动作轻柔，接种Id后应避免把细胞从孵箱中拿出，可根据培养液的颜色和亮度观察污染情况（污染的细胞，培养液混浊、发黄；正常应该是清亮透明的）。3d后1/3量换液，并可利用神经元标志物的免疫化学染色鉴定纯度。第5天起每隔2d 1/2量换液，并可以根据神经元的成熟程度用于实验。 3.如果觉得神经元纯度达不到实验的要求，可以添加阿糖胞苷（终浓度为5µM),作用2d后，1/2量换液，逐渐去除。 培养成功的神经元，无污染，相差显微镜下细胞折光性好，细胞碎片很少或没有，突起长，培养基清亮，细胞有一定的间距，没有成团存在，分布均匀，而且没有太多的杂细胞。培养不太好的细胞，杂细胞多，神经元状态一般或很差，细胞碎片较多
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| 注意事项 |
1.神经元培养时常为1/2量换液，在换液前应将培养液在37℃水浴锅中充分复温，冷刺激和全量换液刺激都会使细胞活力下降。 2.鼠龄越大，其神经元的培养，操作越要轻柔精细，关键在于消化过程和吹打过程。消化时间、吹打次数对细胞活力的影响在原代培养中是最大的。在保证可以获得足够单细胞悬液的前提下，应适当缩短操作时间和步骤。 3.海马和皮层神经元的培养没有大的区别，皮层细胞丰富，很容易收集细胞，但是杂细胞较多。 4.利用孕鼠做神经元的培养，纯度高于新生鼠，而且活力更好。培养海马神经元时，孕期不足，海马尚未完全形成，较难分离，但是取皮层就没关系了。
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| 其他 |
实验心得： 1.应用阿糖胞甘作用于神经元，细胞纯度会高一些。1/2量换液去除时，虽然会存在残留，但是这样的浓度对神经元活性的作用基本可以忽略。 2.在包被玻片时，习惯将8片玻片置于已加入2ml PLL的小皿中，一片一片的加，加完后用弯管小心吹匀，盖上皿盖后，轻轻震摇。再放入孵箱包被过夜。包被结束后，以无菌水漂洗2遍，并以弯摄一片一片的夹出来，置于已灭菌的纱布上，超净台内吹干。 3.接种细胞爬片时，先以(2-4)X105/100µL的浓度配好单细胞悬液，在玻片上接种100µL,静置20min后，移至培养箱培养，2-3h后补液至400µL。这种方法接种的细胞能够均匀分布于爬片上。 4.为了避免长时间培养出现培养液变干的情况，可以在培养板每孔之间的间隙加无菌水。
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