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分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

细胞技术专题：大鼠脑微血管内皮细胞原代培养实验 一

2020.6.16

大鼠脑微血管内皮细胞原代培养可以：（1）应用于血脑屏障的研究；（2）脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究；（3）新药筛选；（4）脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究。

实验方法
实验方法原理丁香园站友参考文献采用以大脑皮质为材料、酶消化及梯度离心分离脑微血管段并进行原代培养,，成功地摸索出大鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养的方法，并获得纯度较高的脑微血管内皮细胞。
实验材料

SD大鼠

试剂、试剂盒

纤连蛋白 Ⅳ型胶原 明胶 肝素钠 碱性成纤维细胞生长因子 青霉素 链霉素 NaHCO3 牛血清白蛋白 鼠尾胶 葡聚糖 DNA酶I D-Hanks'液 II型胶原酶

仪器、耗材

低温离心机 离心管 移液枪

实验步骤

一、实验材料准备
 

1.  实验动物
 

每次实验采用10只2-3周龄SD大鼠，雌雄均可，体重40~60 g。

2.  试剂
 

纤连蛋白(fibronectin)、Ⅳ型胶原、鼠尾胶、葡聚糖(dextran，分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)购自Sigma公司；D-Hanks'液、10×PBS按配方自制；II型胶原酶购自Worthington公司；明胶、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES购自Amresco公司；Percoll 购自Amersham Biosciences；DMEM(高糖)购自GIBCO/BRL公司；肝素钠、NaHCO3购自中国医药集团上海化学试剂公司；青、链霉素购自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)购自PAA Laboratories；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胶原酶/分散酶(collagenase/dispase)购自Roche公司。
 

3.   仪器
 

低温离心机(Centrifuge 5810 R，购自Eppendorf；Himac CR 22F，购自Hitachi)。
 

4.  试剂配制
 

（1）1 mg/ml鼠尾胶(用0.2%乙酸配制)，1%明胶(用D-Hanks'液配制)，1%II型胶原酶(用DMEM配制，用时稀释成0.1%的浓度)，1%胶原酶/分散酶(用DMEM配制，用时稀释成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配制)，20% BSA(用DMEM配制，调pH值至7.4后用0.45 μm滤膜过滤除菌，较难过滤)，DNase I(用冷PBS配制成2 U/μl)，以上试剂经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装保存于-20℃。

（2）50%Percoll(配12 ml，需6 ml Percoll原液，0.67 ml 10×PBS，0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培养液(含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素钠 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 μg/ml)，pH值调至7.4，过滤除菌后分装保存于4 ℃，用时加入20% FBS及1 ng/ml bFGF。
 

二、培养皿预处理
 

1.  涂布3种不同的基质，培养前一天加入1 ml 1%明胶于35 mm塑料培养皿，置于37 ℃培养箱过夜，接种前用D-Hanks'液漂洗2次。

2.  接种前4 h，加入鼠尾胶6~10 μg/cm2，在密闭的器皿里用氨气熏5~10 min后，置于室温1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。

3.  50 μl 0.1%纤连蛋白、50 μl 1 mg/ml Ⅳ 型胶原和400 μl双蒸水混合后，加入到每个培养皿中涂布均匀后吸出，可涂布10个培养皿，置于37 ℃培养箱1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。


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