基因表达系列分析实验（SAGE）（一）
实验方法原理
实验材料 感兴趣的细胞或组织
试剂、试剂盒 糖原EDTA缓冲液SDSBSATween 20连接子T4 DNA 连接酶BsmFIPC8SeeDNA乙酸钠乙醇DMSOPCR引物乙酸铵DNA ladder 聚丙烯酰胺 TBE凝胶DNA参照pZErO-1 质粒TE缓冲SOC培养液Tris · Cl
仪器、耗材 微量离心管水浴锅带冷冻的热控制 循环仪96 孔 PCR 板干冰 甲醇浴台式离心机平台型摇床UV 盒滤镜Spin-X 离心过滤管微电击杯Bio-Rad 基因脉冲电转装置培养管
实验步骤
实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」
1. 刮取细胞时准备 Dynabeads ，洗涤缓冲液和 5×第一链缓冲液混合液（置于冰上）。
2. 充分悬起 Dynabeads oligo （dT）25，转移 100 ul 到一个无 RNase 的硅烷化微量离心管里，置于磁座上。30 s 后去除上清，不要扰动磁珠。
3. 轻弹或轻轻涡旋把磁珠重悬于 500 ul 裂解/结合缓冲液中。把磁珠留在缓冲液里直到准备把它加到细胞裂解液里。加到细胞裂解液里前移出磁珠。
4. 在一个 2 ml 的微量离心管里用 1ml 的裂解/结合缓冲液裂解 100 000 ～ 1000 000 个细胞（或 2～10 mg的组织），用组织匀浆器匀浆 1 min。如果有必要的话，最高速离心 1 min 去除细胞残渣。使用匀浆器前，彻底清洗，再用 100％ 的乙醇淋洗，用 1L 的 DEPC 处理的双蒸水洗涤。
5. 立刻用一个 1 ml 的注射器使裂解液通过一个 23-G 的针头撕裂基因组 DNA 。把洗过的磁珠和裂解液混合，室温用手连续晃动温育 3～5 min。
6. 把管子放到磁座上 2 min，弃掉上清（上清可以保存用作 DNA 的实验）。
7. 用一个 P200 带滤芯的吸头上下吹吸洗涤磁珠。按下面的顺序洗涤：
7.1 1 ml 含20 ug/ml 糖原的洗涤缓冲液 A（1 ml 洗涤缓冲液中加入 1 ug 20 mg/ml 的糖原），两次。
7.2 1 ml 含20 ug/ml 的糖原的洗涤缓冲液 B， —次。
7.3 200 ul 1× 第一链缓冲液混合液（用 DEPC 水从试剂盒中的 5× 第一链缓冲液混合液稀释），4次。
8. 把磁珠重悬于下面的第一链合成混合液里：
54 ul DEPC ddH2O
18 ul 5× 第一链缓冲液
9 ul 0.1 mol/L DTT
4.5 ul 10 mmol/L dNTP
把管子置于 37°C 2 min， 然后加入 3 ul 200 U/ul SuperScript II 逆转录酶。37°C 温育 1 h， 每 10 min 用手混匀磁珠。把管子置于冰上中止反应。
9. 在冰上往第一链的反应里加入如下第二链合成的成分，次序如下：
227 ul ddH2O， 预冷
150 ul 5× 第二链缓冲液
15 ul 10 mmol/L dNTP
3 ul 10 U/ul E.coli DNA 连接酶
12 ul 10 U/ul E.coli DNA 聚合酶 I
3 ul2 U/ul E.coli RNase H
16°C 温育 2 h， 每 10 min 用手混匀磁珠。
10. 温育后，把管子置于冰上加入 100 ml 0.2 mol/L EDTA 中止反应。
11. 用含 0.1％ SDS 和 2× 乙酰化 的 BSA 的 1×BW 缓冲液洗一次（ 如果不加 BSA ，珠子会变得很黏）。
12. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1XBW 缓冲液洗 3 次。重悬在 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液中，70°C 加热 20 min 失活 Poll 的核酸酶活力。
13. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液洗 3 次。然后用 200 含 2×BSA 的 1×NEB 缓冲液4 （随 NlaⅢ 提供）洗 2 次（第一次用 NEB 缓冲液/ BSA 洗完后转移到一个新管里）。取 5 ul 最后的磁珠悬液，用已知存在于所要建库 cDNA 中的基因引物，PCR 检查 cDNA 的完整性
14. 把磁珠重悬于下面的混合液中：
171 ul LoTE 缓冲液
4 ul 100×BSA
420 ul 10×NEB 缓冲液 4
5 ul NlaⅢ
37°C 温育 1 h。
15. 温育后，把管子置于磁座上约 30 S，然后用下面的溶液和 P200 带滤芯的吸头上下吹吸几次洗涤：
500 ul 含 1％ Tween 20 和 2×BSA 的 1×BW 缓冲液，2 次
500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液，4 次
200 ul 1×T4 DNA 连接酶缓冲液，2 次
最后重悬于连接酶缓冲液后，每个样品转移 100 ul 到 2 个新的硅烷化的微量离心管里。
16. 移弃最后的洗涤液，珠子重悬在下面的溶液里：
5 ul LoTE 缓冲液（两管）
2 ul 5×T4 DNA 连接酶缓冲液（两管）
3 ul 2 ng/ul 连接子 1A，B （已复性的；管 1）
3 ul 2 ng/ul 连接子 2A，B （已复性的；管 2）
17. 50°C 加热管子 2 min 后置于室温 5～10 min。每管中加入 1 ul 5 U/ul 高浓度 T4 DNA 连接酶，16°C 温育 2 h。间歇混匀。
18. 连接后，置于磁座上约 30 s，然后每个样品用 500 ul 含 0.1 ％ SDS 和 2×乙酰化的 BSA 的 1×BW 缓冲液洗两次（第一次洗后合并管 1 和管 2，以减少后续步骤的损失）。
19. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液洗 4 次 ； 用 200 ul 含 2×BSA 的 1×NEB 缓冲液 4 洗两次（第一次用 NEB 缓冲液/BSA 洗后，转移到一个新的管里）。
20. 65°C 预热下面的混合液 2，重悬起磁珠：
170 ul LoTE 缓冲液
4 ul 100×BSA
20 ul 10×NEB 缓冲液 4
2 ul BsmIII
65℃ 温育 1 h，间歇混匀。
21. 温育后，最高速离心 2 min， 然后转移上清到一个新的 1.5 ml 的微量离心管。用 40 ul LoTE 缓冲液洗一次，最后终体积为 240 ml。
22. 用 240 ul PC8 抽提，用 4 ul SeeDNA 乙醇沉淀：
22.1 加入 4 ul SeeDNA ［或 4 ul 3：1 （V/V） 的糖原和 SeeDNA 混合物］
22.2 加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠（24 ul）， 混匀
22.3 加入 2 倍体积的 100％ 乙醇（480 ul）， 混匀
22.4 室温温育 2 min
22.5 最高速离心 5 min
22.6 70％ 的乙醇洗两次，最后一次洗完后再离心一次，用吸头小心地移出并弃去残余液体，重悬于 10 ul LoTE 缓冲液。
23. 加入下面的混合液：
30. 5 ul ddH2O
5 ul 10×Klenow 缓冲液（或 Roche 缓冲液 H）
2.5 ul 10 mmol/L dNTP
1 ul 100×BSA
1 ul Klenow
37°C 温育 30 min 后，加入 190 ul LoTE 缓冲液（240 ul 终体积）。
24. 用等体积（240 ul） 的 PC8 抽提。转移 200 ul 到一个连接酶「＋」的管里，余下的 40 ul 到连接酶「-」的管里。
25. 用 2 ul SeeDNA、0.1 倍体积乙酸钠和 2 倍体积的 100％ 乙醇沉淀。70％ 乙醇洗两次，最后一次洗完后再离心一次，用吸头小心移去残余液体，晾干 5~10 min。重 悬于 2 ul LoTE 缓冲液。
26. 准备 2× 连接酶「＋」混合液：
2.5 ul 3 mmol/L Tris·Cl， pH 7.5
3.0 ul 5×T4 DNA 连接酶缓冲液
2.0 ul 5 U/ul 的高浓度 T4 DNA 连接酶
准备 2×连接酶「-」混合液：4.5 ul 3 mmol/L Tris ·Cl， pH 7.5 和 3.0 ul 5× T4 DNA 连接酶缓冲液。加入 2 ul 合适的混合液到＋/- 连接酶样品里，在热循环仪上 16°C 过夜（8～12 h）。
27. 连接后，加入 98 ul LoTE 缓冲液，优化 PCR 条件，然后进行大规模的 PCR 扩增。
28. 准备大规模 PCR 的反应混合液（2～3 个 96 孔板，每孔 50 ul 反应液），每个反应的成分如下：
5 ul 10×SAGE PCR 扩增缓冲液
3 ul DMSO
4.0～10 ul 10 mmol/L dNTP
1 ul 350 ng/ul PCR 引物 1
1 ul 350 ng/ul PCR 引物 2
用 ddH2O 调整体积到 49 ul
0.7 ul 5 U/ul Platinum Taq DNA 聚合酶
每孔分装入 49 ul 反应混合液，然后加入 1 ul 适当稀释的模板。
29. 热循环仪运行如下程序：
1 轮：
2 min 94°C
26～32 轮：
30 s 94°C（变性）
1 min 55°C（复性）
1 min 70°C（延伸）
1 轮：
5 min 70°C（终产物延伸）
连接酶「-」的样品应当扩增 35 轮。
不要对 Platinum Taq DNA 聚合酶使用传统的热启动 PCR。
30. 把 PCR 反应物混合到一个 50 ml 的锥形管里，用 LoTE 缓冲液扩大体积到 11.5 ml， 然后用等体积的 PC8 抽提。
