还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计
的使用。
二、原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm
波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1． 实验材料
小麦面粉；精密pH 试纸。
2． 主要仪器
（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11
（2）大离心管：50mL×2
（3）烧杯：100mL×1
（4）三角瓶：100mL×1
（5）容量瓶：100mL×3
（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1
（7）恒温水浴锅
（8）沸水浴
（9）离心机
（10）扭力天平
（11）分光光度计
3． 试剂
（1）1mg/mL 葡萄糖标准液
准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5- 二硝基水杨酸（DNS）试剂
将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
（3）碘-碘化钾溶液：称取5g 碘和10g 碘化钾，溶于100mL 蒸馏水中。
（4）酚酞指示剂：称取0.1g 酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。
（5）6M HCl 和6M NaOH 各100mL。
四、操作步骤
1． 制作葡萄糖标准曲线
取7 支20mL 具塞刻度试管编号，按表1 分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长
540nm，用0 号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。
2． 样品中还原糖和总糖的测定
（1）还原糖的提取
准确称取3.00g 食用面粉，放入100mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL
蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL 离心管中，于4 000r/min
下离心5min，沉淀可用20mL 蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL
容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
（2）总糖的水解和提取
准确称取1.00g 食用面粉，放入100mL 三角瓶中，加15mL 蒸馏水及10mL 6M
HCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1
滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH
中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL
容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。
（3）显色和比色
取4 支20mL 具塞刻度试管，编号，按表2 所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0 号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
五、结果与计算：
计算出7、8 号管光密度值的平均值和9、10 管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
六、附 注
1． 离心时对称位置的离心管必须配平。
2． 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。
3． 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。
七、思考题
1．3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?
2．如何正确绘制和使用标准曲线?
参考答案
1．植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，可直接测定。而没有还原性的寡糖和多糖，需用高浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖，还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基
-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系，利用分光光度计，在540nm
波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
2．标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边1.5~2cm，标示出刻度和葡萄糖的毫克数；纵坐标轴距坐标纸左边
1.5~2cm，标示刻度和光密度值；曲线为过原点的直线，测定点均匀分布在直线的两侧；标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下，用于确定样品中的物质含量。对于重复的测定，应取吸光度的平均值查标准曲线；测定数据不应记在标准曲线上。
