1. TIL的分离及培养
(1)取荷瘤小鼠20只,处死后无菌条件下切除皮下瘤块,置于RPMI 1640培养液中,剔除坏死的肿瘤组织及表面结缔组织,剪碎过细胞筛收集单细胞悬液。
(2)将等体积的比重1.088及1.075淋巴细胞分离液及细胞悬液先后分别置于离心管中进行不连续密度梯度离心,经1800 r/min 离心20 min 后,1.075界面上为富含肿瘤细胞悬液,1.088与1.075之间界面为富含TIL悬液。
(3)收集TIL,用含10%小牛血清,IL-2100 u/ml RPMI1640培养液稀释调整细胞浓度成5×105/ml进行培养,分两组。
(4)一组每5天加入冷冻瘤苗,浓度为效应细胞/肿瘤细胞(E/T)=50/1,另一组不加冷冻瘤苗进行常规培养。
(5)培养条件为37℃,5%CO2,每5天计数1次,维持细胞浓度5×105/ml。
2. 冷冻瘤苗的制备
(1)取肿瘤细胞悬液,用RPMI 1640培养液稀释成1×105/ml 装于冻存管中
(2)用液氮速冻慢融3个冻融周期,置于-20℃冰箱中贮存,备用。 3. 荷瘤小鼠模型的制备
(1)抽取腹水型Hepa种鼠腹水,用生理盐水稀释至肿瘤细胞1×106/ml,于小鼠右侧腋窝皮下接种0.2 ml。
(2)1周后肿瘤长至直径约0.5 cm 左右即制成小鼠荷瘤模型供检测TIL抗肿瘤作用。
(3)待肿瘤生长至直径1~2 cm 时供分离TIL使用。
4. 培养后TIL的抗肿瘤作用分3组,每组20只小鼠。对照组瘤体内注射生理盐水0.2 ml;实验1组,瘤体内注射常规培养TIL1×106个;实验2组,瘤体内注射加入冷冻瘤苗培养TIL1×106个。隔3天注射1次,共6次。
5. 病理检查处死小鼠,测量肿瘤大小,结果用垂直方向直径平均值表示。肿瘤组织送病理检查,常规HE染色。淋巴细胞浸润程度根据Anneroth等的标准分为4级。0级为无浸润;Ⅰ级为淋巴细胞浸润仅限于肿瘤灶周围,面积不超过肿瘤25%;Ⅱ级为淋巴细胞向瘤灶中央浸润,面积占肿瘤25%~50%;Ⅲ级为淋巴细胞浸润面积超过肿瘤50%。
6. 统计学方法采用t检验和X2检验。 展开 |