细胞碱性磷酸酶染色
实验概要
细胞碱性磷酸酶染色
实验原理
胚胎干细胞中碱性磷酸酶的活性比较高，
5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸盐（BCIP）能被碱性磷酸酶水解，形成一个中间体，这个中间体能与氯化硝基四氮唑蓝，也称氮蓝四唑（NBT）反应生成白色的中间二聚体和NBT-蓝紫色结晶物。通过染色结果可以相对得知碱性磷酸酶的活性，进而从侧面来证明实验细胞是否具有多能性，90%的克隆显色视为阳性。
主要试剂
DPBS、4% PFA、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）染色试剂盒
主要设备
倒置显微镜
实验步骤
（1）将贴壁培养的细胞用DPBS 洗3遍。
（2）加入4% PFA，固定细胞30 min。
！注意：多聚甲醛有毒，易挥发，对眼睛有刺激作用，在通风橱内操作，做好防护。
（3）吸弃4% PFA，然后用DPBS冲洗贴壁细胞3次。
（4）按照如下比例加入各溶液，混匀后配成BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品：
| 碱性磷酸酯酶显色缓冲液 | 3 mL | 10 mL |
| BCIP溶液(300X) | 10μL | 33μL |
| NBT溶液(150X) | 20μL | 66μL |
| BCIP/NBT染色工作液 | 3.03 mL | 10.1 mL |
（5）37℃避光孵育5～30 min或更长时间（最长可达24 h），直至显色至预期深浅。
（6）DPBS洗3遍后，存放于DPBS溶液中保存，正置显微镜下拍照。
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