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正常小梁细胞原代培养

2020.7.13

实验材料:

1.    材料来源:人眼、兔眼或者猪眼等;

2.    清洗液:不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素,pH7.2;

3.    器械:小梁剪与无齿镊等;

4.    消毒液:200IU/ml的庆大霉素生理盐水;

5.    培养液:基础液由DMEM培养基加入HEPES 6.0g/L、NaHCO32.2 g/L以及L-谷氨酰胺0.06 g/L配制而成。应用液是在基础液内补加15%的胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml,并用5% NaHCO3调节pH至7.0—7.2;

6.    培养器皿:培养瓶、24孔培养板或培养皿若干;

 

实验方法:

1.    将离体的供体眼球用200IU/ml的庆大霉素溶液浸泡消毒5min;

2.    无菌条件下,沿角膜缘后5mm处环形剪开眼球,剪断晶状体悬韧带,去除晶状体和玻璃体;

3.    将眼前段倒放在培养皿中,在显微镜下用无齿镊把虹膜抹离角膜内皮面,暴露房角结构。用角膜剪紧贴虹膜与巩膜的附着部位,剪除色素膜;

4.    以PBS溶液或平衡盐溶液轻微冲洗小梁组织表面。用小梁剪伸入Schlemm管,楔形剪取小梁组织。前界至Schwalbe线,后界至巩膜嵴。环形取出一块小梁组织,置于培养皿中;

5.    经PBS漂洗后将小梁组织剪碎,几乎成浆状;

6.    用无齿镊挑起少许小梁组织,接种于24孔培养板后培养瓶皿中,轻轻铺平。待组织稍干后加入适量培养液,在CO2培养箱静置培养。第四天后开始换液,每周2次


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