副溶血性弧菌检验（二）
制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，加热煮沸使琼脂溶化，加入0.2％酚红溶液12.5mL，摇匀，分装试管，121℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。
（五）氯化钠血琼脂（我妻氏培养基）
| 成分：酵母膏 | 3g |
| 蛋白胨 | 10g |
| 氯化钠 | 70g |
| 磷酸氢二钠 | 5g |
| 甘露醇 | 10g |
| 结晶紫 | 0.001g |
| 琼脂 | 15g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
制法：调pH8.0，加热30min（不必高压），待冷至45℃左右时，加入新鲜人或兔血（5％~10％），混合均匀，倾注平皿。
（六）嗜盐性试验培养基
| 成分：蛋白胨 | 2g |
| 氯化钠 | 按不同量加入 |
| 蒸馏水 | 100mL |
| pH7.7 |
（七）3.5％氯化钠生化试验培养基
| 成分：牛肉膏 | 5g |
| 蛋白胨 | 10g |
| 氯化钠 | 35g |
| 磷酸氢二钠 | 2g |
| 0.2％溴麝香草酚蓝溶液 | 12mL |
| 蒸馏水 | 1000mL |
| pH7.7 |
制法：将上述成分配好后，根据所需的糖发酵管分别加入各种糖类，葡萄糖发酵管可按0.5％葡萄糖加入后，分装有小倒管的试管内，121℃高压灭菌15min。其他培养基可分装为每瓶100mL，121℃高压灭菌15min，另将各糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌后，取5mL糖液，加入100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
（八）葡萄糖食盐胨水（MR-VP试验用）
| 成分：多胨 | 5g |
| 葡萄糖 | 5g |
| 磷酸氢二钾 | 5g |
| 氯化钠 | 30g |
制法：加入1000mL蒸馏水，振摇加热，使全部溶解，冷却后分装小试管，121℃高压灭菌15min。
（九）食盐胨水（靛基质试验用）
| 成分：蛋白胨 | 20g |
| 氯化钠 | 30g |
| 蒸馏水 | 1000mL |
| pH7.4 |
制法：按上述分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。
（十）运动性试验培养基
| 成分：牛肉膏 | 3g |
| 蛋白胨 | 10g |
| 氯化钠 | 30g |
| 琼脂 | 4g |
制法：将全部成分加入1000mL蒸馏水，加热溶解，分装试管，121℃15min高压灭菌，最终pH7.4。
第二节 副溶血性弧菌参考检验方法
一、日本食品微生物检验方法
（一）分离、菌数测定
图6-2 分离、菌数测定程序
（二）鉴定
将TCBS平板上生长典型或可疑的菌落挑取2个以上，接种以下培养基：
图6-3 鉴定程序
（三）检查用培养基
1. 3％氯化钠蛋白胨稀释液：蛋白胨10g、氯化钠30g溶于1000mL蒸馏水中，校正pH7.0，121℃15min高压灭菌。
2. TCBS
| 成分：酵母膏 | 5g |
| 蛋白胨 | 10g |
| 蔗糖 | 20g |
| 硫代硫酸钠 | 10g |
| 柠檬酸钠 | 10g |
| 牛胆酸钠 | 3g |
| 牛胆汁粉 | 5g |
| 氯化钠 | 10g |
| 柠檬酸铁 | 1g |
| 溴麝香草酚蓝（2％溶液） | 20mL |
| 草酚蓝（1％溶液） | 4mL |
| 琼脂 | 15g |
| pH8.6 |
制法：将上述成分加蒸馏水至1000mL，混合，使全部溶解，校正pH为8.6，加热煮沸，不需高压灭菌，倾注平皿15~20mL。
不分解蔗糖的副溶血性弧菌，在此培养基上生长呈蓝绿色菌落，分解蔗糖的细菌呈黄色菌落。
3. 我妻氏琼脂（改良）培养基
| 成分：酵母膏 | 5g |
| 蛋白胨 | 10g |
| 氯化钠 | 70g |
| 甘露醇 | 5g |
| 结晶紫（0.1％酒精溶液） | 1mL |
| 琼脂 | 15g |
制法：将全部成分溶于1000mL蒸馏水中，调正pH为7.5，至完全溶解后，加热煮沸数分钟，不需高压灭菌，冷却至50℃时，加入洗净的20％浓度的人红血球悬液100mL，混合均匀后倾注平皿。
红血球悬液的制备：将人的脱纤维血液，离心沉淀的血球，用0.85％灭菌生理盐水洗3次，最后沉淀的红血球，用生理盐水制成1:4的悬液。
4. 亚硫酸铋肉汤
| 成分：蛋白胨 | 10g |
| 氯化钠 | 25g |
| 氯化钾 | 0.7g |
| 氯化镁 | 5g |
制法：加蒸馏水950mL溶解，调pH为9.1，121℃高压灭菌15min，室温冷却，加亚硫酸铋溶液100mL及95％酒精1mL，混匀，无菌手续加入灭菌试管，每管100mL，不需加热。
亚硫酸铋溶液配制：①热水100mL，加亚硫酸钠20g；②热水100mL加柠檬酸铋铵0.1g；③将①加②溶解甘露醇20g，煮沸1min，最终成白色混浊的混合物，使用前摇匀。于冷库贮存，可使用1个月。
5. 食盐碳水化合物肉汤基础液
| 成分：蛋白胨 | 2g |
| 硫酸钠 | 2.5g |
| 氯化铵 | 5g |
| 磷酸二氢钠 | 0.5g |
| 磷酸氢二钠 | 1.5g |
| 0.2％溴麝香草酚蓝溶液 | 12mL |
制法：将全部成分溶于1000人工海水中，分装试管，每管5mL，121℃15min高压灭菌，冷却后分别加碳水化合物10％灭菌溶液0.5mL。碳水化合物溶液需过滤或115℃10min高压灭菌。
人工海水的配制：氯化钠23.4g，氯化钾0.66g，硫酸钠3.91g，重碳酸钠0.19g，氯化镁4.96g，将上述全部成分溶于1000mL蒸馏水。
6.Hugh-Leifson食盐培养基
| 成分：蛋白胨 | 2g |
| 氯酸钠 | 30g |
| 磷酸氢二钾 | 0.3g |
| 葡萄糖 | 10g |
| 琼脂 | 4g |
| 0.2％溴麝香草酚蓝溶液 | 12mL |
| 蒸馏水 | 1000mL |
| pH7.4 |
制法：将上述成分溶解，调pH后加指示剂，分装试管，每管3mL，121℃高压灭菌15min。
试验方法：穿刺接种两种，一管加矿物油覆盖表面，于35~37℃培养，两管同时变黄为葡萄糖发酵，只有不加矿物油的培养管变黄时为葡萄氧化。
二、耐热溶血毒检验方法
根据试验证明，神奈川现象阳性菌株，多数对人的致病性有密切关系，神奈川现象的阳性物质称“耐热性溶血素”，检验副溶血性弧菌是否产生耐热性溶血毒，可参考下述方法：
（一）Sahuria（樱井氏）法
用副溶血性弧菌肉汤培养物上清液为抗原，与制备的精制耐热性溶血毒的抗血清进行琼脂扩散试验，观察沉淀线。
（二）Elek法（本田改良法）
以微研No.1琼脂（Difco胨30g，磷酸氢二钠30g，氯化钠40g，葡萄糖5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.3）培养37℃过夜，在平板上菌落旁约为5mm处放一小滤纸片（上吸有抗血清），室温放一夜，观察滤纸旁有无沉淀红。
（三）液体培养检验法（饭田民）
用2％氯化钠肉汤，加入少量新鲜红血球，倾斜培养，神奈川现象阳性菌株能引起溶血，而阴性菌株不溶血。
（四）反相被动血球凝集法（太田氏）
用吸附抗体的红血球测定抗原（溶血毒），此方法极为敏感，可查出微量耐热性溶血毒。并发现神奈川现象阴性的菌株也产生少量的耐热性溶血毒。
三、至病性试验方法
（一）兔肠袢结扎试验
选用正常健康家兔，首选使家兔断食24h，用乙醚麻醉，将腹壁切口，露出小肠，选取肠段约5cm左右，于两端结扎，注入检菌的肉汤培养物，同时另选两段作阳性和阴性对照，然后迅速缝合，24h后由耳静脉注入空气杀死，开腹检查，有致病性者注菌肠段可见肿胀积液，出现坏死现象。
一般认为神奈川现象阳性菌株，兔肠袢结扎试验多数为阳性反应，神奈川现象阴性菌株多数为阴性，但亦有少数为阳性者。
（二）新生兔经口试验
选用1~2日龄的新生家兔，将检菌的培养物经口喂入1~2mL，有致病性者一般可在10~20h发病，初期症状蜷缩不动，随后呈极度疼痛状，翻滚嚎叫，呼吸急促，痉挛，多数在24h左右死亡，解剖可见内脏充血现象。
无毒株不发病，可对致病性副溶血性弧菌与非致病性溶藻弧菌进行鉴别。
四、血清学检验
进行副溶血性弧菌血清学鉴定时，可用O抗原分群，将18-24h的培养物，用3％食盐水作成较浓的菌悬液，121℃高压1h或100℃煮沸
后，用此菌悬液进行O抗血清玻片凝集试验，同时用无菌生理盐水作对照，如O凝集反应阳性时，可用不经加热的菌悬液进行Ｋ抗血清玻片凝集反应分型判定。
副溶血性弧菌有三种抗原，即O抗原（菌体抗原），Ｋ抗原（荚膜抗原）及Ｈ抗原（鞭毛抗原），日本泷川氏和坂崎氏，根据对本菌血清学特性的研究，经逐年的进展，将副溶血性弧菌分出11个O群，60个K型，63个血清型。关于Ｈ抗原，因与其他弧菌有共同性，至今在血清型别的分类上没有利用。副溶血性弧菌的抗原组合见表6-3。
表6-3 副溶血性弧菌的抗原组合
| o群 | k 型 |
| 1 | 1，25，26，32，38，41，56，58a，64 |
| 2 | 3，28 |
| 3 | 4a，5，6，7，29，30 a，31，33，37，43，45，48，54，57，58 a，59 |
| 4 | 4 a，8，9，10，11，12，13，34，42，49，53，55，63 |
| 5 | 15，17，30 a，47，60，61 |
| 6 | 18，46 |
| 7 | 19 |
| 8 | 20，21，22，39，62 |
| 9 | 23，44 |
| 10 | 19，24，53 |
| 11 | 36，40，50，51 |
| 总计11 | 60k型/63血清型 |
