用于检测副溶血性弧菌的PCR方法介绍
用于检测该菌的PCR方法主要有任意引物PCR(abritrarilyprimedPCR，Ap-PCR)、针对任意引物PCR、多重PCR(muhiplex-PCR)、实时PCR(Real-timePCR)。 1、任意引物PCRMatsumoto等采用任意引物PCR对副溶血性弧菌进行检测。针对该菌的tdh基因和trh基因一段特异的序列，设计两条引物，
引物1：5’--GGTGCGGGAA--3’
引物2：5’一GTTTCGCTCC一3’
对1977～1998年所收集的227株副溶血性弧菌进行PCR。通过电泳分析发现，1996~1998年收集的22株血清型为03：K6菌株与1996年以前收集的03：K6血清型菌株基因序列有所不同，为03；K6血清型新出现的变异株，并最初出现在孟加拉国。这是目前最简单的以基因为基础的细菌亚分型方法。
2、针对任意引物PCR由于临床分离株绝大多数含有tdh基因，因此绝大部分研究者都根据tdh设计引物进行特异扩增。1993年，Lee等根据tdh基因设计引物，对36株TDH+株、89株TDH-株以及46株其他弧菌和肠道菌进行PCR检测。结果显示，36株TDH+株全部特异扩增出来，其余菌株都没有扩增；而检测灵敏度高，最低检测量可至40pg DNA，并可直接检测粪便标本，无需分离培养，方便快速。1999年，Kim等选择toxR基因序列设计两对引物，5’--GTCTTCTGACGCAATCGTTG--3’和5’一ATACGAGTGGTTGCTGTCATG一3’，对14株副溶血性弧菌、14株其他弧菌进行PCR。结果显示，14株副溶血性弧菌都得到一条368bp的特异扩增亮带，而其他菌株没有特异扩增。此外，Venkateswaran等选择gyrB基因设计引物对副溶血性弧菌进行PCR、Cordova等选择pR72H基因设计引物进行PCR，特异性、灵敏度都很好。
3、多重PCR由于不是全部副溶血性弧菌都含tdh基因或trh基因，所以只针对tdh或trh的单一PCR，有时会漏检。多重PCR能全方位高效率地检测该菌。1994年研究人员等针对tdh、trh设计不同的引物对，在同一PCR反应体系内同时扩增tl、tdh、trh。结果显示，所有的副溶血性弧菌都扩增出tl基因，tl基因是该菌特异的；54％的副溶血性弧菌扩增出tdh基因；只有38．73％的副溶血性弧菌扩增出trh基因；该法灵敏度很高。与其他常规生化方法相比，多重PCR更快速，仅8h就能完成检测，结果更为准确、可靠，而且还可改进成定量竞争PCR，对标本中靶序列进行定量。
4、实时PCR常规PCR检测，需要从反应体系中吸取产物做电泳或Southern杂交等试验进行鉴定，转移过程中易污染，造成假阳性，而且耗费时间。1996年，Tyagi开创了一种实时PCR(Real-time PCR)。实时PCR是在PCR反应体系中加入标记有报告基团和淬灭基团的线性Taqman探针或茎环型荧光分子信标探针，在基因扩增过程中，与产物杂交，此时，报告基团和淬灭基团分开，根据能量共振转移现象，报告基团发出荧光而被检测。这种方法操作简单，闭管检测，减少污染，灵敏度高，并且可以在PCR结束或PCR过程进行同步定性或定量检测，面且可以进行临床大规模快速检测。
