细胞免疫荧光染色
实验概要
细胞免疫荧光染色
实验原理
利用抗原抗体反应，鉴定细胞是否表达某种蛋白。细胞经固定后，用特异性抗体（一抗）识别目的蛋白，再用一抗的抗体（二抗）识别一抗，二抗一般耦联荧光基团或化学反应基团，通过荧光或化学发光显示目的蛋白。
主要试剂
防淬灭剂、DPBS、指甲油、4% PFA、10 μg/mL PI、10 μg/mL Hoechst 33342、封闭液、BSA、Triton-X100
主要设备
玻璃片、细胞培养皿、激光共聚焦显微镜
实验步骤
①将洁净无菌的玻璃片放在细胞培养皿底部中央，接种细胞，待细胞生长到合适密度时，弃培养液，室温用4% PFA固定细胞。
注意：细胞固定时间取决于染色的细胞类型，单层细胞需要固定10 min左右，mESCs和hESCs需要20 min左右，如果是胚胎或者拟胚体（Embryoid Bodies, EBs）需要30 min以上。
②洗涤：吸弃4%PFA，然后用DPBS洗3次，每次5 min。
③通透：用0.5% Triton-X100室温通透细胞。
注意：1. 细胞通透时间取决于染色的细胞类型，单层细胞需要通透10 min左右，小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞需20 min左右，如果是胚胎或者拟胚体需要30 min以上。
2. 膜蛋白的抗体染色可以不用通透。
④封闭：加入足够量的封闭液，确保覆盖住所有细胞，室温孵育1 h。
⑤加一抗：弃去封闭液，加入用抗体缓冲液稀释的一抗（具体稀释倍数参考相应的抗体说明书），用封口膜封好培养皿，4℃过夜。
⑥吸弃一抗，用洗涤缓冲液洗3次，每次5 min。
注意:1.为避免非特异性结合，至少洗3次，每次5 min，在摇床上摇动洗涤。
2.每个孔换一个枪头，避免抗体交叉污染
⑦加二抗：加入用抗体缓冲液稀释的二抗（具体稀释倍数参考相应的抗体说明书），避光、室温放置1 h。
⑧用洗涤缓冲液洗3次，每次5 min。
注意:为避免非特异性结合，至少洗3次，每次5 min，在摇床上摇动洗涤。
⑨染核：用10 μg/mL Hochest33342溶液覆盖细胞20 min。
⑩加入洗涤缓冲液，在摇床上摇动洗涤1 min。
⑪封片：每张玻片上加5 µL防淬灭剂，用盖玻片倾斜覆盖于组织上，避免产生气泡，用指甲油小心地在盖玻片四周轻涂，使盖玻片与玻璃片黏合
⑪激光共聚焦显微镜下拍照。
