体液还原型谷胱甘肽浓度比色法定量检测试剂盒使用说明
主要用途
体液还原型谷胱甘肽（REDUCED GLUTATHIONE）浓度比色法定量检测试剂是一种旨在使用Ellman试剂与还原型谷胱甘肽反应，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物，呈现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定样品中还原型谷胱甘肽含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种体液包括尿液、脑脊液、唾液、精液等的还原型谷胱甘肽的检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，重复性好。
技术背景
谷胱甘肽（glutathione）是一种三肽分子，即γ-谷氨酰半胱胺酰甘氨酸（γ-glutamylcysteinylglycine），也是含有硫醇（Thiol）最为丰富的化合物，广泛存在于动物、植物、细菌和酵母细胞中。且90至95％以还原型形式存在。其功能在于1）作为谷胱甘肽转移酶的亲核性底物（nucleophilic substrate），进行外源性化学物质（xenobiotics）的解毒；2）作为谷胱甘肽过氧化酶的电子供体，还原氢过氧化物（hydroperoxides）；3）参与氨基酸转运和蛋白硫氢基（sulfhydryls）还原状态的维持、以及抗氧化作用等。细胞内谷胱甘肽的水平是细胞健康的敏感指标。通过还原型谷胱甘肽的硫氢基团与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析还原型谷胱甘肽的含量，其反应方式为：
产品内容
抗干扰液（Reagent A） 毫升
缓冲液（Reagent B） 毫升
底物液（Reagent C） 毫升
标准液（Reagent D） 微升
稀释液（Reagent E） 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存抗干扰液（Reagent A）和缓冲液（Reagent B）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent C）和标准液（Reagent D）避免光照；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品和标准品制备的容器
微型台式离心机：用于样品处理
恒温水槽：用于反应孵育
96孔板或200微升1厘米光径比色皿：用于比色的容器
酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析
实验步骤
实验开始前，设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长412nm，并置零。然后进行下列操作。
一、样品准备（尿液/脑脊液/唾液/精液样品）
准备好1.5毫升离心管
移取1毫升液体到离心管
放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
（选择步骤）移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
移取500微升到新的1.5毫升离心管
加入预冷的xx微升去干扰液（Reagent A）
涡旋震荡5秒，充分混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
小心移出上清液到另一个新的预冷的1.5毫升离心管
放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用（建议2小时内检测）
二、标准样品配制
准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
分别加入xx微升稀释液（Reagent E）到2至5号管
移取xx微升标准液（Reagent D）到1号管
小心移取xx微升1号管的标准液（Reagent D）到2号管，混匀
小心移取xx微升2号管稀释的标准液（Reagent D）到3号管，混匀
小心移取xx微升3号管稀释的标准液（Reagent D）到4号管，混匀
将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号 | 稀释液（Reagent E） | 标准液（Reagent D） | 测定体系 标准还原型谷胱甘肽浓度 |
1 | － | xx微升 | xx微摩尔/升 |
2 | xx微升 | xx微升1号管 | xx微摩尔/升 |
3 | xx微升 | xx微升2号管 | xx微摩尔/升 |
4 | xx微升 | xx微升3号管 | xx微摩尔/升 |
5 | xx微升 | 0 | 0 |
标准曲线测定
移取xx微升缓冲液（Reagent B）到新的比色皿
加入20微升上述配制的标准液
上下倾倒数次，混匀
在37℃温度下孵育5分钟
加入xx微升底物液（Reagent C）
上下倾倒数次，混匀
室温下，孵育10分钟
即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
重复实验步骤1至10四次
构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准还原型谷胱甘肽浓度（微摩尔/升）
样品测定
移取xx微升缓冲液（Reagent B）到新的比色皿
加入20微升上述准备的待测样品
上下倾倒数次，混匀
在37℃温度下孵育5分钟
加入xx微升底物液（Reagent C）
上下倾倒数次，混匀
室温下，孵育10分钟
即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
根据标准曲线获得样品对应还原型谷胱甘肽浓度（微摩尔/升）
计算样品实际还原型谷胱甘肽浓度（微摩尔/升）
酶标仪测定
在96孔板上做好相应标记：标准样品和待测样品
分别移取xx微升缓冲液（Reagent B）到相应孔里
分别加入20微升上述配制的标准液或待测样品
轻轻摇动96孔板
在37℃温度下孵育5分钟
加入xx微升底物液（Reagent C）
轻轻摇动96孔板
室温下，孵育10分钟
即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数
构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准还原型谷胱甘肽浓度（微摩尔/升）
根据标准曲线获得样品对应还原型谷胱甘肽浓度（微摩尔/升）
计算样品实际还原型谷胱甘肽浓度（微摩尔/升）
注意事项
本产品为50次操作，包括标准样品
操作时，须戴手套
本产品检测1至100微摩尔还原型谷胱甘肽
如果样品进行了抗干扰液（Reagent A）处理，建议在2小时内完成检测；如果需要保存样品，以后再行检测，建议未经抗干扰液（Reagent A）处理，直接保存在－70℃冰箱里
样品中避免含有各种还原性化学物质，包括巯基乙醇（2-mercaptoethanol）、二硫苏糖醇（dithiothreitol；DTT）、半胱氨酸（cysteine）和N-乙基顺丁烯二酰亚胺（N-Ethylmaleimide；NEM）等
样品还原型谷胱甘肽浓度范围不清楚，建议进行系列稀释样品2至3次
如果用户没有412nm波长的滤波器，可以使用405nm波长替代
比色测定后，比色皿须清洗彻底
如果待测样品浓度过高，可以稀释样品
如果待测样品浓度过低，可以浓缩样品或延长孵育时间至30或40分钟
本公司提供系列谷胱甘肽分析试剂产品
