外周血细胞形态学检验及技巧（二）
3． 染色步骤：
（ 1 ）先用甲醇固定 2 ～ 3 分钟。
（ 2 ）将血或骨髓涂片放置 姬 姆萨使用液 15 ～ 30 分钟。
（ 3 ）涂片用自来水冲洗，在室温中干燥待查。
（五）瑞 氏及姬姆萨 染色液的鉴定：刚配好或放置一个月以上的染液可进行下列鉴定：
1 ．取 1 滴染液于乳白 玻 板上，自行迅速扩散开，其颜色变紫红色，且有伪足形成。
2 ．取 1 滴染液加 1 滴缓冲液，染液由深蓝 色立即 变为紫红色。
3 ．取血片或骨髓片 进行试染检查 ，观察染色后各类细胞的胞核、胞浆及颗粒着色情况， pH 是否合适及染色合适时间。如有上述变化，表明染液合格，可供使用。
（六）瑞氏染色 (Wright ' s)- 姬 姆萨（ Giemsa ' s ）混合染色：
瑞氏染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适中
, 细胞核结构和色泽清晰艳丽 , 对核结构的识别较佳 , 但对胞浆着色偏酸 , 色泽偏红 ,
对细胞浆内颗粒特别是嗜天青颗粒及嗜中性颗粒着色较差 , 而姬姆萨染色对胞浆着色能较好的显示胞浆的嗜碱性程度 ,
特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰 , 色泽纯正 , 而对胞核着色偏深 , 核结构显示较差 , 故采用以瑞氏染液为主 姬
姆萨染液为辅的混合染色。
染色步骤 :
1. 先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖；
2. 稍等片刻再加姬 姆萨 染液 2-3 滴加减 ( 根据涂片上细胞多少及增升程度酌情而定 ) ；
3. 稍等 1-2 分钟后 , 再加磷酸盐缓冲液 , 加时应缓慢地 一 滴一滴加在涂片膜上 , 直至膜面上染色 液形成 表面张力而终止染色液加入；
4. 染色 30-40 分钟；
5. 分色：用自来水缓缓冲洗至少 3 分钟以上 , 待干，勿用滤纸吸干 , 以免滤纸纤维污染涂片。
四．血液学及血细胞形态学内容及自身特点：
（一）血常规检查（
Hb 、 RBC 、 WBC 、 Plt 、血细胞比积、 RBC-MCV 、 MCH 、 MCHC
及血小板容积曲线），用自动化仪器提高工作效率，为使结果准确可靠，必须建立监测方法，搞好质控，此属数值质控。我国已较普遍开展全国、省、市（地区）质控。但普遍存在应付质
控质量 的问题，并未能切实解决自身质控问题。
（二）白细胞分类：白细胞分类的自动化已普遍应用，只能为患者普查与筛选之用。遇有问题应用显微镜观察，弥补自动化仪器缺陷。一般医院显微镜档次偏低，分辨率低，正确使用和维修欠缺，因而要更好地发挥光镜的观察效应。
（三）骨髓、外周血细胞形态学及分类，是血液病及临床各科患者基本检查及诊断依据。反映继发性疾病的血液学表现，了解机体状况、感染（细菌、病毒、寄生虫等）等改变。
（四）血细胞涂片自身的特点：
1 ．涂片不易均匀：由于血液是混悬液，其中白细胞、有核细胞、 RBC 、血小板的形态大小、比重及生物活性和血浆成分等的不同和制片技术差异、质量分布不均匀性差异颇大。
2 ．细胞分布和检查的非随机性：
(1) 细胞分类标准与观念不一；
(2) 采样和计数 100~200 个白细胞的局限性；
(3) 细胞分布的生理变动；
3. 与疾病的相关性；
4. 室内、室间分类不一致性，开展室间质控也是促进形态学提高重要手段。
（五）血细胞形态学（外周血及骨髓）质控：自 1983 年以来，澳大利亚皇家病理学质控中心和英国皇家进修学院 WHO 质控中心及最近美国洛杉矶质控中心，国内：全国及省地市也普遍开展，由质控标本涂片发展图片指定细胞识别。
五．血细胞形态学采样、制片染色与检查要求：
( 一 ) 采样、制片及染色，三道工序至关重要，是细胞形态学检查的成败关键。要得到合格的涂片标本，做好上述工序，应注意以下要求：
1. 采样、制片：
(1) 玻 片要求：国内 1.0mm × 26mm × 76mm ± 0.5 ，美国 NCCLS 规定 1.0mm × 25mm × 75mm ± 0.5 ，要严格清洁，接近中性 .
(2) 推片：选择优质推片， 推片两端 边缘整齐、平滑。也可选用有机玻璃，其大小、厚度 与坡片相同 ，两端之边缘 应加工 光滑， 以利推片用 。
(3)
采外周 血（样），擦去第一滴血，迅速采血，量适中，如绿豆粒大小，具有 一定推片技术 ， 推片倾斜 45 °±，推成血膜长度 25mm ～
35mm ，宽度 18 ～ 20mm ，血膜四周留有空隙区，血膜 终尾离玻 片终端至少 10mm
，血膜均匀，薄如蝉翼，尾端形如弧状，迅速扇（摇）干，血膜具有头、体、 尾不同
厚薄区域。此外，涂片时，还要考虑患者的血液状态，如贫血程度、血液粘稠度、 WBC 或有核细胞多少等因素， 调整推片技巧 。
(4) 如若采用静脉血推片，用 K 3 -EDTA 或肝素抗凝， 推制血 片应尽早进行（最迟在 1 ～ 2 小时内）。
（二）染色：是识别细胞形态的重要标记工序：
常规瑞氏 - 姬姆萨染色要点：
1 ．要得到满意、漂亮的血细胞染色标本，新鲜涂片迅速染色是很重要的。
2 ．染色液配制要合格；
3 ．涂片切勿用甲醛固定，否则不着色；
4 ．染色的好坏与染色液、缓冲液的质量及比例、加液间隔时间、保持 玻 片染色液面的张力等染色技巧均有重大关系。染液要覆盖涂膜面，再加缓冲液（ 1:2 ），其量要充足、混均，染色时间要 30 分钟以上。
5 ． 细胞着色的观察：
(1)
当染液与缓冲液混合后，甲醛吸水液温升高，发生剧烈反应，直至液膜表面的“染色粒”呈均匀分布，随染色时间的推延，“染色粒”由“染色小粒”聚集成“染色大粒”，逐渐由外缘向内缘推进至
染色面 中心（此过程需要 20-30 分钟以上），则表明细胞着色已完成，
(2) 再用自来水缓流冲洗，使染色液沉渣及染色粒浮去，使其充分起分色作用，去除细胞染色中浮色，显示出胞核结构及细胞清晰形态，待干，镜检。
六．外周血细胞形态检查技巧：
外周血中三种血细胞数与形态学表现是：
● 反映骨髓造血状态及血液病和其他疾病的 厨窗 ；
● 是检查与观察疾病的重要指标；
（一） WBC 形态学诊断技巧：
1 ． WBC 数值准确性估计：
（ 1 ）目前自动化计数仪时有出现结果的偏差，低倍镜观察血涂片可以粗略估计 WBC 数值及分布。低倍视野 WBC 数：正常约 3~5 个，增多 6 个以上，减低 3 个以下。
（ 2 ） WBC 如推至片尾，分布不均，估计将有一定难度。较大的细胞如单核、异淋及中性粒细胞及不成熟细胞多在片尾，体部则多为较小的淋巴细胞，使分类造成偏差，所以分类部位在适当调整。
2 ． 白细胞计数值限度分级：
（ 1 ） WBC 正常范围： 4.0~10.0 × 10 9 /L;
（ 2 ） WBC 正常限度以下 :
● 轻度减少 (<4.0 ～ 3.0 × 10 9 /L),
● 中度减少 (<3.0 ～ 2.0 × 10 9 /L),
● 极度减少 (<2.0 × 10 9 /L);
（ 3 ） WBC 正常高限度以上 :
● 分轻度增多 (>10.0 ～ 20.0 × 10 9 /L),
● 中度增多 (>20.0 ～ 40.0 × 10 9 /L),
● 明显增多 (>40.0 ～ 80.0 × 10 9 /L)
● 极度增多 (>80.0 × 10 9 /L) 。
以此与所测知 WBC 计数值作粗略对比，推断 WBC 计数值的准确性。
（ 4 ）如在血片分类计数过程中发现较多有核红细胞时，
● 计出血片中有核红所占 % 率，即以校正原 WBC 计数值减去有核红所占比例，求出外周血中 WBC 总数值，
● 另作 WBC 分类计 100 个过程中遇到多少有核红细胞，即有核红细胞 个 /100 个 WBC ，
● 或作血片有核细胞分类计数（包括有核红细胞），计出有核红细胞所占 % 率。
3 ． WBC 分类正常范围及其病理性改变：
（ 1 ） WBC 分类正常范围：
● 新生儿出生后最初 24 小时白细胞数高，主要为中性粒细胞 , 至第 3 ～ 4 周，中性粒细胞与淋巴细胞比例倒转，直至 4 岁淋巴细胞比例仍多。表 1
● 白细胞分类正常范围由于民族、地区、年龄、性别及其生理性变化的影响，以及检查本身的技术差异，即使一人同次取材不同涂片、一张涂片多次分类计数结果也不可能完全一致，但不可差异太大。
● 分类中占大比例的中性粒细胞或淋巴细胞呈正态分布，占小比例的嗜酸 / 嗜碱性粒细胞及单核细胞则为 Poisson 分布。
（ 2 ） 病理性形态学改变：
①中性粒细胞：
● 中性粒细胞分叶分化程度，被认为从干细胞至粒细胞生成是否正常及与粒细胞年龄相关；如核分叶不良， Pelger-huet 现象； 核仅一叶 或二叶，其百分率增加时谓之“左移”，反之，多数细胞四叶以上谓之右移，一般认为正常中性粒细胞胞核分叶情况：
4 叶者为 15 ～ 25% 3 叶者为 40 ～ 50%
2 叶者为 20 ～ 40% 1 叶者为 < 5%
血象中如有多个 5 叶以上者提示有巨幼细胞性贫血的可能。
右移现象
—多见于巨幼细胞性贫血、肝脏疾患，并可以 5 叶与 4 叶所占比例计算，得出简单实用的分叶指数：
分 叶指数 =5 叶 /4 叶 × 100% 正常核分叶指数： 0 ～ 17%
—还见于 缺铁性贫血、类风湿性关节炎、遗传性高分叶症（显性遗传）及某些败血症（以左移多见）。
左移—见于感染、败血症、出血、小儿慢性中性粒细胞减少症等。
● 中性粒细胞毒性颗粒及空泡改变：中性粒细胞由于受到外来刺激（包括感染及应激反应）引起颗粒变性，粗大 着色深染 及浆内空泡等病理性改变。上述改变及白细胞数增多和出现幼稚及原始细胞则为类白血病反应。
● 慢性粒细胞白血病（ CML ）的中性成熟粒细胞一般胞浆颗粒较正常稀少，但无空泡及毒性颗粒，而慢性中性粒细胞白血病（ CNL ）的中性成熟粒细胞则与类白血病反应形态相似。
● 假性嗜酸性颗粒—在某些干细胞疾病如 MDS 、粒细胞缺乏症、肾性贫血某些患者中性粒细胞的颗粒增多，形态异常，类似嗜酸性样颗粒的出现。
● 遗传性白细胞异常疾病：是先天性白细胞异常疾病，临床上虽罕见，但为了提高辨别的能力，应有所认识。
Pelger-Huer
白细胞异常：属于显性遗传，其白细胞形态特点：核分叶不良，不分叶，核呈花生形、 亚铃形等 形状，无核丝形成，胞浆正常，此外，还有假性（ 即继发
性） Pelger-huet 白细胞异常应加以鉴别，后者常见于急性肠炎、伤寒、疟疾、流感，无家族史，但在原发病得到治疗后白细胞形态恢复正常。
Alder-Reilly 颗粒异常：常染色体隐性遗传性多糖代谢障碍性疾病，常伴有软骨畸形、肝、脾肿大等，中性、嗜酸性及嗜碱性粒细胞含有多量嗜天青颗粒遮盖整个细胞，单核细胞亦有类似改变。
May-Hegglin 异常：为常染色体显性遗传疾病，在中性及嗜酸性粒细胞 浆 内含有 Dunle 小体，常伴有巨血小板及血小板减少、紫癜，由于细胞的游走功能差，故病人常出现感染症状。继发性也可见于猩红热、球菌性感染、烧伤早期等某些病例。
②嗜酸性粒细胞： 此种细胞在人体每日规律性变动，晨至午下降，午后始升，午夜至次晨 3 时达高峰数值，哮喘患者及夜间工作者其规律与正常相反，晨 9 至 12 时达高峰。
