免疫电镜技术关键的几个问题
免疫电镜技术关键的几个问题
免疫电镜集电子显微技术与免疫细胞化学技术于一体，能显示抗原或抗体在细胞超微结构水平的位置，已成为当今生物医学领域的一项重要研究手段。由于免疫电镜制作过程长，操作程序烦锁，因此，要得到满意的免疫金染色切片，必须在关键环节上给予注意，以下我们就免疫电镜染色技术中的几个问题进行探讨。（相关实验技术服务：免疫电镜技术服务）
1、染色标本的固定
理想的免疫电镜标本固定既要保存组织的抗原，又要具有良好的细胞超微结构。对于多数抗原，按常规电镜技术固定标本会使其抗原性部分或完全消失，因此，免疫电镜常用一些特殊的固定液，如过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液(PLP)、4%多聚甲醛固定液、多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液( PG)（相关试剂：戊二醛 25%溶液）及苦味酸-多聚甲醛固定液。我们在实际工作中发现，用1%多聚甲醛加0.01% -0.05%的戊二醛最理想。此固定液不但配置简单，而且效果满意。当然，对于某些抗原性较强的标本，也可采用4%多聚甲醛加0.05%~0.5%的戊二醛固定。有的甚至可以直接采用常规电镜固定液固定。
2、包埋剂的选择
被检组织采用包埋前或包埋后方法进行免疫染色，应视被标记抗原的情况而定。通常对仅检测细胞表面的抗原选择包埋前染色，这样，不存在脱水、浸透及聚合对细胞抗原的破坏规包埋剂即可。相反，包埋后染色是在标本包埋后才进行免疫染色，对抗原常常造成较大的破坏，因此，应根据待检抗原的性质选择合适的包埋剂．以减少对抗原的破坏，提高阳性检出率。Epon812为最常用的电镜包埋剂，它要求标本在包埋前必须彻底脱水，一般还需要在60℃聚合，因此，对抗原性往往有较大的破坏。我们在工作中采用低温长时间聚合，45℃3天，日的减少聚合反应对抗原性保存的影响。为了减少对组织抗原性的破坏，以获得很强的阳性染色结果，不少实验室应用低温包埋剂、透明合成树脂及水溶性包埋剂（乙二醇甲酯）。通常在铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的包埋后染色中，采用低温包埋剂。
3、抗血清和探针
要获得理想的免疫染色，选择具有特异性高、亲和力强的抗血清是实验成功的首要条件。一般实验所用的一抗都是通过市场购买（点击查看：查找抗体），购置的一抗浓缩液在使用前须用抗体稀释液稀释，本文认为包埋后免疫电镜染色用的一抗浓度要高于光镜染色的使用浓度10~100倍。有时造成染色失败的原因之一，就是因为把光镜免疫组化染色的抗体作为一抗。
探针一般用于电镜下观察，通常使用胶体金显示。胶体金探针既可以通过市场购买，也可以按Slot方法自己制备。一般制备的胶体金直径为5nm，10nm，15nm几种规格。
4、特异性吸附问题
免疫电镜染色时，通常使用胶体金作为探针，然而胶体金是一种高度敏感的探针，如何克服背景，提高染色结果的特异性便成为胶体金免疫电镜检查的关键环节。使用效价高、特异性强的一抗和活性稳定、浓度适当的免疫金探针以及高质量稀释度合适的抗体是克服背景污染、获得理想标记结果的重要条件。随着稀释度的增加，污染蛋白的影响会逐渐减弱。一般在检测某种新的抗原时，须通过方阵滴定来确定一抗及金标抗体的稀释度。另外，还可以使用高盐及含去污剂的缓冲液进行洗脱，以减少背景污染，通常在缓冲液中加入氯化钠及Triton X-100，使其浓度分别为2.5%及1%即可。当然一抗和金探针时问的合适，也很重要。一般时间一抗24 h(4℃)，金探针常温2h。在实验中，我们常用正常羊血清(1:50-1:100)或1%牛血清白蛋白作为封闭剂，以阻断非特异性吸附。
