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免疫电镜技术

2018.3.16

近年来，免疫学方法与电镜技术相结合，形成了一种免疫电镜技术(Immunoelec-tronmicroscopy，IEM)，使抗原定位达到了亚细胞水平。该技术由以下环节组成：

(一) 组织准备　用于免疫电镜检测的组织多种多样，所以各自在组织制备时都具有其特点。一般讲，组织力新鲜并进行无活动力状态处理，例如树胶包埋等，避开高温(55-56℃)，所用溶液都应是中性缓冲液。

1.固定　常用的固定液有甲醛和戊二醛。使用时要注意固定试剂pH值，渗透压应调整到“生理”状态。另外四氧化锇也是一种良好的表面膜稳定剂。

2.固定后处理　组织块长时间浸于脱水溶剂、液相树脂中时会抽走分子较小的可溶性抗原，另外超薄树脂包埋切片长时间与免疫试剂使用(如24-48h)会引起形态学的改变，而采用冰冻切片在很大程度上弥补了这一缺点。近年来，有人在后处理时对组织进行急冻，然后真空抽干，再用锇蒸气固定后，可用阿朱伯树脂包埋。

(二) 切片制备

1.冰冻超薄切片是免疫电镜技术中应用最广泛的。先将细胞或组织轻微固定后，用2.3mol/L蔗糖浸润后速冻，然后进行切片。辣根过氧化物酶标记，或胶体金、铁蛋白、萄聚糖铁标记的抗体均可用于该方法的免疫染色。

2.包埋前处理技术　这一方法作为首选用于细胞表面抗原及受体的定位，亦可用于检测那些易被脱水剂及树脂成分变性的抗原。首先用于切片刀将新鲜或固定的组织切成20至100微米厚，然后用改良的间接免疫酶技术进行染色，在试剂中加入曲通X-100增加其穿透性，用四氧化锇后固定，增加DAB染色反差。最后再包埋制超切片。一般认为，在组织中切面下方2-4μm是染色较理想的定位。

3.包埋后切片技术　包括两种方法，一是用包埋好的组织切成一般切片，免疫染色后用于光镜检查，同时作系列超薄切片染色后用电镜观察，将光镜得到的结果与电镜观察结果比较，推断抗原所在部位，这一方法的缺点是不能在亚细胞水平直接定位。另一种方法将包埋后组织直接进行超薄切片后染色，酶标记与胶体金标记的抗体可用于这一方法。

(三) 标记物选择

1.辣根过氧化物酶　是最常用的一种标记物，性质稳定，分子量小，易穿透组织，在档记过程中几乎不受损。其底物为3,3’-二氨基联苯胺，可通过锇化或氧化钻作用增加其电子刻度。

2.铁蛋白及葡聚糖铁颗粒首先用于免疫电镜标记的是马脾脏铁蛋白。应用双功试剂(如间位苯二甲基二异氰酸（m-Xylyene diisocynate)可将铁蛋白偶联于抗体球蛋白分子上，因铁蛋白分子量大不易穿透，故常采用冰冻超薄切片技术和包埋前处理切片技术。葡聚糖铁颗粒用于免疫标记时可采用上述方法。

3.放射性标记　该方法已有人应用，采用内标记法将同位素标记到抗体球蛋白分子上。

4.重金属　应用不广泛。用胶体金、水银、铁、铀标记抗体等。铀离子能非特异性结合在整个抗体分子上。因此需先将抗原与抗体结合，再将抗原与抗体分开，除去抗原成分，即得到未失去免疫活性的铀标记抗体。胶体金能吸附于免疫球蛋白上，吸附的抗体以30000r/min离心沉淀，胶体金标记抗体可保存6个月(5℃)不耐冻结。

5.血蓝蛋白　无脊椎动物的血蓝蛋白形态规则，在电镜下容易辩认，可从鲎、角螺、文蛤等的血淋巴液中提取，其分子量达900万，可用ConA、戊二醛将抗体球蛋白分子联结于血蓝蛋白上。

(四) 免疫电镜技术操作方法　标记抗体染色程序可根据不同需要，进行直接法、间接法、杂交抗体等方法，就象酶标记抗体一样。下面介绍几种常见的免疫电镜操作程式。

1.不需要标记的病毒电镜凝结试验　近年来由于电镜技术的发展，病毒的电镜凝结已被用作常规的检验手段。用于电镜检查的病毒悬液需先经适当的提纯和浓缩。细胞培养中的病毒经冻融裂解后，差速离心使病毒沉淀，将沉淀的病毒悬于适量生理盐水中，取一滴病毒悬液和一滴抗血清，混合后4℃过夜，然后再加一滴3% 磷钨酸负染，滴于被有炭膜的铜网上，吸干，即可作电镜检查。可见病毒颗粒凝结成团并见有抗体分子的晕，病毒颗粒之间保持着一定距离。在最佳透射条件下，还可看到单独的、近球形的抗体分子，有时在病毒颗粒之间形成桥。检查时，要注意与自然形成的病毒团块相区别，必需设未加血清的对照。电镜凝结试验可进行病毒的确切鉴定。

2.冻结超薄切片的免疫染色　将组织用甲醛或戊二醛固定，切成0.5mm3大小，置0.6-2.3mol/L蔗糖溶液中渗透，然后速冻（液氮等），超薄切片，展于用炭膜包被后的铜网上，切片面向下置于含0.3%琼脂和1%明胶的湿盘上，通过渗透作用除去蔗糖，再用含0.0-0.2mol/L甘氨酸的PBS（PBS-g）漂浮铜网，然后在铜网上滴加含2%明胶PBS，放置10min，再按下列步聚进行：

(1) PBS-g液中置10 min后，PBS漂洗；

(2) 采用工作浓度的一抗体血清孵育，稀释液中常加明胶或白蛋白(0.4 W.V)，孵育的温度与时间都需要试验比较得出；

(3) PBS漂洗；

(4) 胶体金标记二抗(工作浓度、作用时间和温度均需进行测定)作用后，PBS漂洗；

(5) 置于含2%戊二醛水溶液中5min后，水漂洗，晾干后电镜观察。注意同时设置阴性、阳性对照。

3.辣根过氧化物酶-抗辣根过氧化物酶（Peroxidaseantiperoxida-se，PAP）　组化法这一方法主要用于包埋前切片技术。首先将组织用含4%甲醛和0.2%戊二醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）浸泡固定2-4h（4℃），再用2.3mol/L蔗糖溶液渗透6-8h，液氮速冻后放在2.3mol/ L蔗糖溶液中解冻，然后转移到PBS中。这一速冻和解冻过程中主要是为了不影响超微结构的前提下冻破细胞以便于标记物及免疫试剂的顺利穿透。

(1) 用Vibratome将组织切成20-50μm厚的薄片；

(2) 10%正常血清（如山羊或猪血清）作用30-60min，PBS漂洗；

(3) 加第一抗体（如兔血清）作用过夜；

(4) PBS洗，用第二抗体（羊抗兔血清1:10-1:100）作用1h，PBS洗；

(5) 与辣根过养化物酶―兔抗辣根过氧化物酶复合物（PAP）（1:50）作用1.5-2h，PBS洗；

(6) 置于含0.06%DAB、0.01%H₂O₂的0.05mol/L Tris-HCL pH7.6溶液中10min，然后浸入PBS溶液中终止反应；

(7) 用1%四氧化锇作用2h，PBS漂洗；

(8) 脱水进行树脂包埋，制电镜超薄切片后观察。

免疫电镜技术为抗原亚细胞水平定位提供了有力工具，也为病毒病快速诊断提供了一个新方法。近几年来，有些科技工作者利用不同标记物在电镜下呈现不同的形态和电子密度的特点，建立了一些双标记或多标记免疫电镜技术，可在同一应系统中，同时观察不同抗原及受体在细胞表面和细胞结构中的定位。

参考文献

[1] 殷震等主编，动物病毒学，科学出版社，1985

[2] 杜念兴主编，兽医免疫学，上海出版社，1985