脑片膜片钳实验方法（二）
二、海马脑片的膜片钳记录
1、将刺激电极放置在含突触前纤维脑片区域附近
在突触传递的研究中，应该同时记录突触前和突触后神经元的电信号，虽然，并不是所有突触前神经元胞体的动作电位均可传导至突触 (Vincent,
1996)。由于在突触前和突触后两个神经元上同时做膜片钳记录较困难，因此，需要用其它的方法来诱发突触前动作电位的发放。用刺激电极可在单个或多个突触前细胞或轴突诱发动作电位。另外，还可以用局部施加神经递质的方法来诱导动作电位，如用短促的压力、离子电泳或笼锁谷氨酸光解等方法将谷氨酸加到突触前胞体或轴突上，可以诱导出多个动作电位。
用电极刺激
在神经元培养皿中，可以用连接了电源(通常是膜片钳放大器)的微电极直接刺激突触前神经元。在这种情况下，通常需要用负压吸引使突触前的细胞贴紧刺激电极，防止刺激电流的逸出。通过膜片钳放大器给脉冲刺激的优点是，它可以记录到突触前细胞被激活的胞外电信号(Role,
1987)。从培养的神经元和脑片上找到有突触联系的一对神经元是很困难的，但在神经元培养中有单个神经元的Autapic突触就会方便许多。
可以用膜片钳电极或尖端较细的一对钨电极给突触前轴突纤维施加电压脉冲。用电极刺激可将Ag/AgCl电极置于孵育槽中与其构成一电流回路。刺激电流一定要与膜片钳放大器记录电路隔离开，以防止刺激电流漏入记录电极中，而使刺激尾迹变得很大。为此，施加刺激需要一个未接地的隔离器。隔离器可以用外界脉冲刺激或计算机来控制。另外，还需要将刺激尾迹缩小到最小，以排除其对突触信号起始段的干扰。为达到该目的，需将刺激电路的回路电极置于合适的位置或用膜片钳放大器提高串联电阻补偿的效率。
刺激电极的位置
通常将刺激微电极或刺激电极置于突触前轴突通过的部位。但有时突触前轴突在制备脑片时即被去除。如果脑片制备时局部神经环路被破坏，实验中就很难成功地记录到突触后电流。实际上，切脑片的角度是保存局部神经环路最重要的因素之一，合适的角度既可使突触后神经元保存完好，也可保留部分较长的突触前纤维用于电刺激。用胞外电极刺激激活的神经纤维较多，而且，每次刺激激活的纤维数目也会不同。如果实验目的是将不同的传导通路分开，那么，必须要证明两个刺激电极激活的纤维各不相同。
2、全细胞记录
用可视化膜片钳寻找清楚、且表面光滑、折光性较好的突触后神经元。在加了正压后，将记录电极移入脑片视野中，并接近事先选好的神经元，然后，调整电极与神经元的相对位置，利用负压形成稳定的高阻封接。用短簇的脉冲负压使细胞破膜，稳定2~3分钟，观察封接测试波形起始段与基线间的差值是否在100pA以内，封接电阻是否大于200M，如果是，且较稳定，再迅速补偿串联电阻和慢电容，舍弃串联电阻大于30M的细胞，且在记录过程中监测串联电阻的变化，当变化大于20%时，中止记录。如果细胞状态不好，就马上重新制备脑片，以提高实验效率。
3、判断突触前纤维
在记录电刺激的突触反应时，可以验证刺激电极是否放置在突触前神经元或轴突上，在实验中，如果记录不到突触反应，说明刺激电极位置不正确，这时可以稍微移动刺激电极的位置。如果还记录不到，这可能还与组织片活性较差有关，可以更换组织片或改进切片角度加以解决。电刺激方波时程一般设定为0.1~0.2ms，恒流条件下刺激强度一般为0.1~3mA，恒压条件下刺激强度为5~40V.
