脑片膜片钳实验方法（三）
4、突触反应的判断及其波幅稳定性的评价
突触信号的判断
突触信号样的假象波有三个来源。第一、邻近纤维的活动使静止细胞产生电压波动；第二、如果恒流刺激强度过大，电流就可被注入突触后神经元，使其产生失活时间类似EPSP或EPSC的信号，其信号幅度随刺激强度的变化而变化；第三、直接刺激突触后神经元诱导出突触样的动作电位，这种反应紧接着刺激尾迹发生，没有翻转电位，使突触后神经元膜电位超极化和向记录电极内液中加入10mM的QX-314，均可避免突触后神经元产生动作电位。但QX-314可阻断多种突触激活的通道(Otis,
1993)，在某些情况下它还可以增加漏电流。
多突触激活
通常情况下，刺激电流可激活多个突触前纤维，在突触后可记录到多种突触信号。因此，有必要用一些选择性阻断剂阻断一些不在研究范围内的突触活动。而且，刺激一束纤维，通常可激活多个同种的突触前纤维。不同的刺激强度下，被激活的突触前纤维数目不同，从而引起的突触反应也会不同。因此，要仔细调节刺激部位和刺激强度以便能刺激到单一的轴突(Stevens,
1995; Zhang, 1994a)。胞内刺激突触前细胞是刺激单个轴突最好且最稳定的方法。
甚至在单个突触前神经元被激活后，在突触后记录到的反应也是由多种神经递质共同作用的结果。多突触活动是突触活动的叠加效应，这包括去极化和超级化反应。在一些标本中，这是不可避免的。通常可用药物阻断不在研究范围内的突触活动。提高灌流液中钙镁等二价阳离子的浓度至5mM，以增加动作电位的阈值，就可以有效地减少多突触活动。通常情况下，突触反应是否来自单突触可以根据如下条件来判断：潜伏时在0.5~1.5ms的范围内，高频刺激时突触反应立即消失，突触反应的上升支和下降支较平滑，且无长潜伏时成份(Berry,
1976)。
电刺激引起的突触反应波幅在一定范围内的波动是一种正常现象，但记录过程中有电流衰减发生，当记录过程中电流衰减大于10~15%，就必须中止实验。如果电流衰减不可避免，就需记录较长时间确定电流衰减的速度。低频刺激(0.1~1Hz)下，记录几分钟，观察突触反应波幅的相对稳定性。
电极内液成份与受体敏感性
在形成全细胞记录后，胞内成份会被电极内液成份所稀释而发生改变，但在10分钟内即可达到平衡。因此，要记录G蛋白耦联受体的活性时，应向电极内液中加入10~100uM
的GTP(Trussell,
1987)。离子通道耦联的NMDA和GABAA受体的特性在全细胞记录过程中也会随时间的变化而衰减。在记录时可用多种方法来避免或减小其衰减，如提高电极内液EGTA的浓度或用BAPTA等快速络合剂代替EGTA，使胞内钙浓度远远低于1μM；向电极内液中加入mM级的ATP；采用穿孔膜片钳记录等。另外，电极的串联电阻小于10MΩ或突触距胞体较近时受体的敏感性会很快下降。
电压钳制是否准确
在电压钳制不足的情况下，记录突触后电流，虽然，可以为突触药理学和突触效能的活动依赖性的改变提供很有用的信息，但这些数据不能用于突触后电流幅度和时程的准确估计。那么，我们如何判断每次记录时电压钳制的质量呢？如果突触后电流来自树突远端，那么，该突触后电流的钳制质量就较低(Silver,
1996)。另外，还有一些判断钳制质量的方法，如突触电流的上升时间较长(如AMPA受体电流的上升时间大于1ms)；在某一突触后电流的翻转电位下可见到双相的突触后电流等。
评价电压钳制质量最常用的方法就是在一次记录后，绘制上升时间对下降时间曲线图。如果上升和下降时间被树突过滤过，则该曲线呈正相关关系，上升或下降时间与幅度间就会呈负相关关系。总之，上升时间受树突过滤的影响要远远大于下降时间。因此，如果随上升时间的变化，下降时间变化较小，这种情况下的下降时间是可靠的(Hestrin,
1990)。需要注意的是，上升时间与下降时间相关性较差并不足以判断电压钳制的质量。Johnston等对树突上突触反应的钳制效果做了深入的讨论(Brown
and Johnston, 1983; Spruston, 1993)。Husser
(1997)等建议用突触电导随钳制电位的变化来检测树突突触反应的幅度和动力学特性。
在突触后电流较大时也存在钳制的偏差。这时，由电极串联电阻引起的电压降会影响到突触后电流的幅度和形状。若想验证是否存在这个问题，可以向灌流液中加入少许受体的高亲和力的阻断剂，观察突触后电流的时程是否会随其峰值的下降而变化，因为，受体的阻断不会改变其动力学特性(Otis,
1996; Zhang, 1994b)；另外，可以改变串联电阻补偿的水平，观察在不同的补偿水平下突触后电流会不会改变(Llano, 1991;
Takahashi,
1995)。在许多情况下，有可能在发现偏差后更正突触后电流的下降时间。值得注意的是，串联电阻可以带来其它的偏差，如对波形的滤波效应。盲法膜片钳记录中，串联电阻通常要大于10MΩ，因此，这种影响是不可避免的。但可以用公式1/(2pRseriesCM)计算记录系统的过滤水平，确定突触后电流峰值和形状受影响的程度。
