电泳分析常用方法--凝胶电泳
以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法 称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。
琼脂糖凝胶孔径较大,对一般蛋白质不起分子筛作用,但适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广,介绍如下:
⒈琼脂糖凝胶电泳的原理概述 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的检测。
⒉琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术 在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中,DNA 分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比;分子构型也对迁移率有影响,如共价闭环 DNA>直线DNA>开环双链DNA。当凝胶浓度太高时,凝胶孔径变小,环状DNA(球形)不能进入胶中,相对迁移率为0,而同等大小的直线DNA(刚性棒状)可以按长轴方向前移,相对迁移率大于 0。
⑴设备与试剂:琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶,而且制胶与加样都比较方便,故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系,常用的有 TBE(0.08mol/L Tris·HCl,pH8.5,0.08mol/L硼酸,0.0024mol/L EDTA)和THE(0.04mol/L Tris·HCl。pH7.8,0.2mol/L醋酸钠,0.0018mol/L EDTA)。
⑵凝胶制备:用上述缓冲液配制0.5%-0.8%琼脂糖凝胶溶液,沸水浴或微波炉加热使之融化,冷**55℃时加入溴化乙锭(EB)**终浓度为0.5μg/ml,然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中,厚度依样品浓度而定。注胶时,梳齿下端距玻璃板 0.5-1.0mm,待脱凝固后,取出梳子,加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下 1mm处。
⑶样品制备与加样:溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料(0.025%溴酚蓝或桔黄橙)、蔗糖(10%-15%)或甘油(5%-10%),也可使用2.5%FicoⅡ增加比重,使样品集中,每齿孔可加样 5-10μg。
⑷电泳:一般电压为5-15V/cm。对大分子的分离可用电压5V/cm。电泳过程**好在低温条件下进行。
⑸样品回收:电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况,对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收,如电泳洗脱法:在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶,将其装入透析袋(内含适量新鲜电泳缓冲液),扎紧透析袋后,平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中,100V电泳2-3小时,然后正负电极交换,反向电泳2分钟,使透析袋上的DNA释放出来。吸出含 DNA的溶液,进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收。
其它还有低融点琼脂糖法、醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等,但各种方法都仅仅有利于小分子量 DNA片段(<1kb)的回收,随着DNA分子量的增大,回收量显著下降。
