电泳分析常用方法--纸电泳法操作方法
1.仪器装置 包括电泳室及直流电源两部分。 常用的水平式电泳室装置如图,包括两个电泳槽 A和一个可以密封的玻璃(或相应材料)盖B；两侧的电泳槽均用有机玻璃(或相应材料)板 C分成两部分；外格装有铂电极(直径0.5～0.8cm)D；里格为可放滤纸 E的有机玻璃电泳槽架F,此架可从槽中取出；两侧电泳槽A内的铂电极 D经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。 电源为具有稳压器的直流电源,常压电泳一般在 100～500V,高压电泳一般在500～10 000V。
2. 操作法
(1) 电泳缓冲液
枸橼酸盐缓冲液(pH3.0) 取枸橼酸 (C6H8O7·H2O)39.04g 与枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g,加水 4000ml,使溶解。
(2) 滤纸
取色谱滤纸置 1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜,次日取出,用水漂洗**洗液的pH 值不低于4,置60℃烘箱烘干,备用。可按需要裁成长27cm、宽18cm的滤纸,或根据电泳室的大小裁剪,并在距长度方向一端 5～8cm处划一起始线,每隔2.5～3cm 处做一记号备点样用。
(3) 点样 有湿点法和干点法。
湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)中,湿润后,取出,用滤纸吸干多余的缓冲液,置电泳槽架上,使起始线靠近阴极端,将滤纸两端浸入缓冲液中,然后用微量注射器精密点加供试品溶液,每点 10μl,共3点,并留 2个空白位置。
干点法是将供试品溶液点于滤纸上,吹干、再点,反复数次,直**点完规定量的供试品溶液,然后用喷雾器将滤纸喷湿,点样处**后喷湿,本法适用于稀的供试品溶液。
(4) 电泳
于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极,接通电泳仪稳压电源挡,调整电压梯度为 18～20V/cm,电泳约1小时45分钟,取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视,用铅笔划出紫色斑点的位置。
(5) 含量测定
剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸,剪成细条,分别置试管中,各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml,摇匀,放置1小时,用3号垂熔玻璃漏斗滤过,也可用自然沉降或离心法倾取上清液,按各药品项下的规定测定吸收度,并按吸收系数计算含量。
