高效液相色谱仪原理及操作步骤
1. 高效液相色谱仪原理
高效液相色谱仪原理 高效液相色谱仪的使用和原理分析
高效液相色谱法（HPLC）是目前应用广泛的分离、分析、纯化有机化合物（包括能通过化学反应转变为有机化合物的无机物）的有效方法之一。
在已知的有机化合物中，约有80%能用高效液相色谱法分离、分析，而且由于此法条件温和，不破坏样品，因此特别适合高沸点、难气化挥发、热稳定性差的有机化合物和生命物质。HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。
其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。
制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters 公司、Agilent 公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有上海伍丰科学仪器有限公司，上海禾工科学仪器有限公司，大连依利特公司、北京创新通恒、北京温分等。
一、输液泵1.泵的构造和性能输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个质量和分析结果的可靠性。
输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应小于0.5%，这关系到定性定量的准确性；②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续调，制备型应能达到100ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300KG/CM2：④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。
恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔往复泵。恒压泵受柱阴影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵己被淘汰目前应用最多的是柱塞往复泵。
柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱压影响；泵压可达400KG/CM2。ADW主要缺点是输出的脉冲性较大，现多彩采用双泵系统来克服。
双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD为0.1%左右，串联泵为0.2~0.3%），但出现故障的机会较多（因多了单向阀），价格也较贵。二、进样器一般HPLC分析常用六通进样阀（以美国RHEODYNE公司的7725和7725I型最常见），其关键部件由圆形密封垫子（转子）和固定底座（定子）组成。
耐高压（35~40MPA），进样量准确，重复性好（0.5%），操作方便。六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种。
①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50%（最多75%），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。
②用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的5~10倍9最少3倍，这样才能完全置换定量环内和流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。三、色谱柱色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。
对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3,5,7,10UM等，柱效理论值可达5~16万/米。
对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于同系物分析，只要500即可；对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10~30CM左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，不要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。
即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。
在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。四、检测器HPLC的检测器分为两类：通用型检测器和专用型检测器。
1.通用型检测器可连续测量色谱柱的流出物的全部特性变化，通常采用差分测量法，这类检测器包括示差折光检测器、介电常数检测器、电导检测器等，通用检测器适用范围广，但由于对流动相有响应，因此易受温度变化、流动相和组分的变化的影响，噪声和漂移都比较大，灵敏度较低，不能用梯度洗脱。2.专用型检测器用以测量被分离样品组分某种特性的变化。
这类检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，而这一性质是流动相所不具备的，或至少在操作条件下不显示。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、放射性检测器等。
高效液相色谱仪的工作原理？
高效液相色谱仪工作原理；高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，这时整个系统就被流动相充满。当欲分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送，色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万），同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
扩展资料
高效液相色谱仪配置高压二元泵或者低压四元泵，而泵的冲程体积以及混合器的体积大小，均会对色谱基线噪音水平产生影响，特别是在梯度洗脱的时候。一般地泵的冲程体积越小以及混合器的体积相对越大，由输液造成的脉冲相对越小，对于梯度变化的响应能力越高，基线越平缓，
在应用二元泵的时，需要注意的是，当二元混合中的其中一元流动相的比例小于5%的时候，特别是在使用正相等度洗脱对一些医药中间体及终产品进行手性拆分的时候，最好使用单泵预混合的方式。避免由于泵在低比例时泵液精度相对较差，而导致色谱基线出现冲程相关峰，
参考资料来源；搜狗百科--高效液相色谱仪
高效液相色谱仪的基本工作原理
高效液相色谱仪的基本工作原理
高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相） 内， 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数， 在两相中作相对运动时， 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程， 各组分在移动速度上产生较大的差别， 被分离成单个组分依次从柱内流出， 通过检测器时， 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
HPLC原理是什么
原理： 储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别。
被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据就可以以图谱形式打印出来，以便研究人员分析。 扩展资料： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。
①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。 ②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15~30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。 ⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
⑥柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物 ⑦样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。
高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。
高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。 HPLC使用的色谱柱是很细的（1~6 mm），所用固定相的粒度也非常小（几μm到几十μm），所以流动相在柱中流动受到的阻力很大，在常压下，流动相流速十分缓慢，柱效低且费时。
为了达到快速、高效分离，必须给流动相施加很大的压力，以加快其在柱中的流动速度。为此，须用高压泵进行高压输液。
高压、高速是高效液相色谱的特点之一。HPLC使用的高压泵应满足下列条件： a. 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1~10 mL/min）; b. 能抗溶剂腐蚀； c. 有较高的输液压力；对一般分离，60*10^5Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150~300*10^5Pa。
⑴往复式柱塞泵 当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。 反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。
这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。 ⑵气动放大泵 其工作原理是：压力为 p1 的低压气体推动大面积（ SA ）活塞A ，则在小面积（ SB ）活塞 B 输出压力增大至 p2 的液体。
压力增大的倍数取决于 A 和 B 两活塞的面积比，如果 A 与 B 的面积之比为 50 : 1 ，则压力为 5 * Pa 的气体就可得到压力为 250*Pa 的输出液体。这是一种恒压泵。
参考资料：百度百科——高效液相色谱。
HPLC仪的工作原理是什么？
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
特点 1.高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150~350*105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1~10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ~ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70~80%。
高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。
其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 1 .液 — 液分配色谱法（Liquid-liquid Partition Chromatography）及化学键合相色谱（Chemically Bonded Phase Chromatography） 流动相和固定相都是液体。
流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。
达到平衡时，服从于下式： 式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K,K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。
a. 正相液 — 液分配色谱法（Normal Phase liquid Chromatography）： 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液 — 液分配色谱法（Reverse Phase liquid Chromatography）： 流动相的极性大于固定液的极性。
c. 液 — 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。
现在应用很广泛（70~80%）。 2 .液 — 固色谱法 流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。
这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 （X） 和溶剂分子（S）对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下： Xm + nSa ====== Xa + nSm 式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。
当吸附竞争反应达平衡时： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。
] 3 .离子交换色谱法（Ion-exchange Chromatography） IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。
以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下： X-（溶剂中） + （树脂-R4N+Cl-）=== （树脂-R4N+ X-） + Cl- （溶剂中） 当交换达平衡时： KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-] 分配系数为： DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-] [讨论：DX与保留值的关系] 凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。 4 .离子对色谱法（Ion Pair Chromatography） 离子对色谱法是将一种 （ 或多种 ） 与溶质分子电荷相反的离子 （ 称为对离子或反离子 ） 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。
其原理可用下式表示： X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相 式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的。
液相色谱仪使用及工作原理
工作原理： 流动相通过输液泵流经进样阀，与样品溶液混合，流经色谱柱，在色谱柱中进行吸附、分离，最后每一组分分别经过检测器转变为电讯号，在色谱工作站上出现相应的样品峰。
液相色谱的使用： 首先对样品进行预处理，然后进样，进样完毕后，清洗进样口，每次分析结束后，清洗通道，最后关闭仪器。 扩展资料： 液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。
液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致，但由于在气相色谱中以液体代替气相色谱中气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同。 此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定的差别。
主要有以下几力‘面： ①操作条件及应用范围不同 对于气相色谱，是加温操作。仅能分析在操作温度下能汽化而不分解的物质，对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难，致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的机物能用气相色谱分析。
而液相色谱是常温操作，不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合相对分子量较大，难汽化，不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物和高聚物的分离分析，大约占有机物的70%~80%。 ②液相色谱能完成难度较高的分离工作 a.气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，基本不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子主要与固定相相互作用。
而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选择不同比例的两种或两种以上的液体做流动相，增加分离的选择性。
b.液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时，选择余地大；而气相色谱并不可能。 c.液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。
③由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，由色谱柱外区域引起的扩张可以忽略不计。 ④液相色谱中，制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备，但液相色谱尚缺乏通用的检测器，一起比较复杂，价格昂贵。
在实际应用中，这两种技术是相互补充的。 综上所述，液相色谱具有柱效高，选择性高，灵敏性高，分析速度快，重复性好，应用范围广等优点，该法已成为现代分析技术的主要手段之一。
目前在化学，化工，医药，生化，环保，农业等科学领域获得广泛的应用。 高效液相色谱应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。
（1）分离混合物 高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。 通过与试样预处理技术相配合，高效液相色谱法所达到的高分辨率和高灵敏度，可分离并同时测定性质上十分相近的物质，能够分离复杂混合物中的微量成分。
并且随着固定相的发展，还可在充分保持生化物质活性的条件下完成对其的分离。 （2）生化分析 由于高效液相色谱法具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域，并已成为解决生化分析问题最有前途的方法。
（3）仪器联用 高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。高效液相色谱一质谱联用技术受到普遍重视，如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等：高效液相色谱一红外光谱联用也发展很快，如在环境污染分析测定水中的烃类等.使环境污染分析得到新的发展 参考资料：百度百科——液相色谱。
液相色谱仪的原理是什么？用来干什么？
液相色谱仪的原理： 储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
主要用于对高沸点、难气化合物的混合物通过色谱柱核淋洗剂并以实现分离。应用于生物化学、生物医学、环境化学、石油化工等部门。
扩展资料液相色谱仪根据固定相是液体或是固体，又分为液-液色谱（LLC）及液-固色谱（LSC）。现代液相色谱仪由高压输液泵、进样系统、温度控制系统、色谱柱、检测器、信号记录系统等部分组成。
与经典液相柱色谱装置比较，具有高效、快速、灵敏等特点。 高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。
进样系统一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。
输液系统该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47~4.4X10Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。
分离系统该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10~50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2~5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5~10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）。
