目的基因在真核系统中的表达及细胞内的定位实验1
磷酸钙法瞬时转染法
| 实验方法原理 | 将氯化钙，DNA和磷酸缓冲液混合，形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒（沉淀）。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。 |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 转染的前一天在35 mm培养皿中植入细胞（约1×106个细胞），使得第二天转染时细胞汇合率达到50-80%；
2. 转染前1-4小时，换成不含血清和双抗的培养基；
3. 在1. 5 ml无菌的离心管中混合下列药品：
15. 5 μl 2 MCaCl2，最多10 μg质粒DNA，补加TE(pH8. 0)至125 μl；
4. 在无菌的35 mm平皿中加入125 μl 2×HBS(pH7.10)，然后逐滴加入上述混合物，一边加一边充分混合，使磷酸钙沉淀均匀，室温放置20分钟，这时溶液将有非常小的磷酸钙沉淀颗粒形成；
5. 20分钟后，将混合物加入细胞中，37 ℃培养箱中培养4-8小时；
6. 4-8小时后，用含血清的完全培养基替换旧培养基，37 ℃培养箱中继续培养；
7. 在转染后24-72小时将细胞置于荧光显微镜下观察目的蛋白的表达。 展开 |
| 注意事项 | 1. 所有操作都必须在无菌条件下进行； 2. 2× HBS 、2 M CaCl2和TE须经0.22 μm滤器滤菌分装后使用； 3. 沉淀的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。 |
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