华大基因再出手 单细胞转录组学测序技术的系统分析
单细胞转录组测序(Single-cell RNA-seq)是在单细胞水平对转录组（mRNA）进行测序的一项新技术，可发现细胞群体中真正起作用的细胞，特别适合对高度异质性的干细胞、肿瘤细胞及胚胎发育早期的细胞群体进行研究，认识细胞分子机制和基因调控网络。单细胞RNA-seq技术需要在测序前制备文库。
2019年4月9日，华大基因的研究团队在Genome Biology上发表了题为“Comparativeanalysis of sequencing technologies for single-cell transcriptomics”的研究论文。该论文提供了标准化的scRNA-seq资源，其可用于新的scRNA-seq文库制备方案和测序平台进行基准测试。
于此同时，2019年4月2号，深圳华大基因研究院在Genome Research上在线发表了题为Efficient and unique co-barcoding of second-generation sequencing reads from long DNA molecules enabling cost effective and accurate sequencing, haplotyping, and de novo assembly的文章。在这里研究人员开发了stLFR技术，这是一种利用经济的第二代测序技术从长DNA分子中获得序列数据的技术。stLFR代表了一种易于自动化的解决方案，可实现高质量的测序，定相，SV检测，支架，经济高效的二倍体从头基因组装配以及其他长DNA测序应用。
单细胞RNA-seq（scRNA-seq）已成为解剖细胞异质性，解开细胞状态以及识别不同细胞类型的亚群结构的既定方法。使用合成RNA加标法对不同的scRNA-seq方法和技术进行了基准测试。然而，迄今为止，大多数scRNA-seq方法需要cDNA文库与短读取Illumina测序平台兼容。
最广泛使用的Illumina平台使用聚合酶方法逐步测序。通过片段或单细胞cDNA的片段化制备文库，然后添加定制衔接子。模板被淹没在图案化的流动池中，以与固定的引物结合并洗涤以除去未结合的末端。结合但自由的模板末端进一步与附近的引物相互作用，形成桥结构。使用相同的引物通过PCR合成第二链，然后洗涤并重新形成桥。这种桥式扩增通常在流动池的紧密物理簇内产生超过一百万份的模板拷贝。这里，将引物DNA聚合酶和修饰的核苷酸的混合物添加到流动池上的富集模板中。在每个循环期间，每个簇内的片段包含互补的单个修饰的核苷酸和碱基特异性可切割的荧光团，而未结合的片段被洗掉。使用全内反射荧光（TIRF）显微镜对流动池进行成像，以鉴定掺入的，然后裂解修饰的碱。重复进行核苷酸添加、延伸和切割的循环，以确定DNA序列。
mESC scRNA-seq实验和测序的示意图
在这里，研究人员提出第一份报告，将更廉价的BGISEQ-500平台与用于scRNA-seq的Illumina HiSeq平台进行比较。研究人员生成了468个单细胞和1297个匹配的单个cDNA样本的资源，在具有RNA加标的两个细胞系上执行SMARTer和Smart-seq2方案。研究人员使用单端和双端读取在两个平台上对这些库进行测序。这些平台在基因表达的量化和低技术可变性方面具有相当的灵敏度和准确度。
mESC和K562 scRNA-seq实验示意图
研究人员的数据集和比较性能评估为其他学者提供了一个巨大的标准化资源，以进一步调查潜在的技术偏差，包括GC含量、同种型定量、不同单链核糖核酸序列协议的阅读长度的影响、技术和测序平台。匹配的1297个单细胞数据集和注释将作为科学界新协议和计算方法的基准和比较的理想起点。
