真核细胞基因组DNA的提取
实验概要
高等动物,高等植物的基因组相当庞大,如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成,果蝇基因组有1.4×108个碱基对,水稻基因组有1.4×109个碱基对。真核细胞基因组中,约1万-1.5万个可表达的结构基因,其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组,包含了该物种生长,发育,繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量,因而对真核细胞基因组的结构,组成,以及表达调控的研究是至关重要的,而研究的起点就是要获得纯度高-不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染;得率好-以便有足够量用于分析;基因组相对完整-断裂的基因组以便用于以后PCR分析,RFLP分析,基因文库的构建,基因探测等的研究。
本实验以幼嫩的植物材料为试材,介绍了真核细胞基因组DNA提取的流程,首先是机械法破细胞抽提;然后去除蛋白质,糖类等细胞内杂质污染;最后纯化出DNA。
主要试剂
液氮
CTAB抽提缓冲液:2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵) ,1%β-巯基乙醇 1.4mol/L Nacl,20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris-HCl pH8.0
3M NaAC
50mM Tris-HCl pH8.0
20mM EDTA
氯仿:异戊醇(24:1)
异丙醇
70%乙醇
TE buffer
主要设备
瓷研钵
剪刀
高速离心机
离心管
实验材料
幼嫩的植物材料0.5g左右。
实验步骤
1. 取0.5g植物材料,双蒸水洗净,并用滤纸吸干。
2. 植物材料剪成25px左右碎片,放入预冷的瓷研钵中。
3. 加入液氮速冷,研磨成细粉(越细越好)。
4. 在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5ml,60℃保温1小时。
5. 15000rpm,离心10分钟。上清转入另一个新的离心管中。
6. 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),混匀抽提至水乳胶融状。
7. 15000rpm,离心10分钟。
8. 上清转入另一个新的离心管中。
9. 加入2/3倍体积预冷异丙醇,-20℃保温30min-1hr,缓缓混匀DNA成絮状折出。
10. 15000rpm,离心10分钟,弃上清。
11. DNA沉淀用 70%乙醇洗2次。
12. 加入400μl TE buffer溶解DNA。
注意事项
由于真核细胞基因组较大,在操作中应注意动作轻柔,且在低温下进行,以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切,从而获得相对完整的DNA。