骨髓染色体培养同步化操作方案
实验概要
本实验介绍了骨髓染色体培养同步化操作方法。
实验步骤
1. 培养制备
1) 在室温或37±2℃的温度下解冻骨髓细胞染色体同步化套装培养管或培养瓶。
2) 在无菌条件下添加1ml骨髓(加入的量由样本细胞密度决定)至一个试管中或分配5ml瓶装的介质到一个细胞培养瓶中并加入样本。
3) 盖上培养管的盖子。
4) 混合培养管(或培养瓶)中的物质，水平放置(在它的平坦的表面上)，并在37±2℃的温度下温育。没有必要添加CO2, 因为该介质的构成就是为关闭系统中最佳的淋巴细胞扩散而设计的。
2. 培养同步化
1) 经过48-72小时的培养后，添加0.1ml的溶液A并温育一整夜。
2) 温育后，添加0.1ml的溶液B并温育5小时(没有必要清洗细胞)。
3) 添加20ul秋水仙素(10ug/ml)，并在37±2℃的温度下温育60分钟(大约)。如果要获得更多数量的前中期分裂相，可将温育时间减少至15分钟。
3. 染色体固定和玻片制备
1) 温育后，如有必要，将培养转移至一个试管，并用离心机分离3-4分钟，转速为每分钟2.000(更快的转速不会损坏细胞)。
2) 倒掉上层清液，注意不要使细胞粒子松散(推荐留大约0.5ml的物质在试管内)。
3) 有力地重新悬挂粒子。
4) 添加5ml低渗液(滴入H2O、0.56%氯化钾)，并充分混合。
5) 在室温下至少温育7分钟。
6) 用离心机分离3-4分钟，转速为每分钟2.000。
7) 根据步骤2倒掉上层清液。
8) 有力地重新悬挂粒子。
9) 添加5ml Ibraimov溶液(滴入H2O、5%醋酸)，并充分混合。
10) 立即用离心机分离3-4分钟，转速为每分钟2.000。
11) 根据步骤2)倒掉上层清液。
12) 有力地重新悬挂粒子。
13) 添加5ml固定液(甲醇：醋酸，3:1)，并充分混合。
14) 重复步骤10-13。
15) 立即用离心机分离3-4分钟，转速为每分钟2000。
16) 仔细倒掉几乎全部的上层清液。
17) 添加几滴新准备的固定剂，要考虑到滴数应当适合粒子内的细胞浓度。
18) 滴一小滴细胞悬浮液到一块干净且湿润的显微镜玻片上。
19) 放进Optichrome染色体分散仪内，在正确温度和相对湿度的恒定条件下蒸发。
