孔雀石绿检测试剂盒说明书
适用
本试剂盒适用于水产品中孔雀绿的定量检测。
原理
本试剂盒原理是竞争酶联免疫检测方法，利用萃取剂从样品中提取到孔雀石绿.
在固相载体微孔板中加入标准和处理的样品，然后加入孔雀石绿抗体，反应30分洗孔，然后加入HRP标记的孔雀石绿孵育30分后洗板，洗涤后加入显色剂，结合的酶将无色的显色剂转化为蓝色的产物；加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色；在450nm波长进行检测，样品中的孔雀石绿浓度与吸收光强度成反比
。
特异性
与孔雀石绿类似物的交叉反应
Compound %
CR
Malachite green 孔雀绿
100%
Leucomalachite 隐色孔雀绿
1%
Crystal Violet 结晶紫
120%
Leucocrystal Violet 隐色结晶紫
2%
检测限
水产品: 0.5 ppb
试剂盒组成
96孔酶标板：1块（8×12条）。 标准品贮备液（Standard）: 1瓶（0.4ml/瓶），100ppb。
酶标记物：1瓶（25倍, 0.8ml）HRP标记的孔雀石绿结合物
孔雀石绿抗体：1瓶（9ml）
底物显色液：1瓶（16ml）
终止液：1瓶（12ml 、1N HCl）。
结合物稀释液：1瓶（15ml）。
样本稀释缓冲液：2瓶（25ml）
浓缩洗涤液：1瓶（5倍， 100ml/瓶）、酶标板的洗涤。
使用说明书
注意
不要使用过了有效日期的孔雀石绿检测试剂盒，不同批次、不同试剂盒之间的试剂等内容不可混用。不使用被污染和稀释的试剂。使用前将所有的试剂拿到室温（20℃-28℃），但不要超出24小时。孔雀石绿是抗生素应小心对待。终止液为1M的盐酸避免接触皮肤，如果不小心滴到皮肤上要马上用水清洗。洗液是5乘的在使用时要稀释。
还需设备
去离子水或重蒸水
100ml或更大的量筒
样品提取和采集用的玻璃器皿
甲醇
25、50、100 和250μL 单道或多道移液器
计时器
旋涡混合器
洗瓶
吸水纸
离心机
450nm 滤光片的酶标仪
样品制备(肉 1:20 稀释)
1 鱼虾去皮取肉，用匀浆器均质样品，称取5g均质好的样品置于离心管中2 加入10 mL乙腈，振荡器震荡30分
3 4000g离心10分钟
4 轻轻倒出上清, 移入到另一个离心管。
5 用3ml乙腈活化氧化铝柱（1-2滴/秒）。
6 取3ml样品过柱。
7 收集样品于一干净试管中。
8 加入3ml乙腈洗柱并收集与上述步骤7试管中。
9 利用样品稀释液1：10的比例稀释洗脱物（50ul+450ul），待用。
第二种前处理方法： (1:10 稀释)
1. 样品均质后称取4g于离心管中；
2. 加入5ml 0.2MHCL，充分混合5min；室温2000g离心5min
3. 吸取2.5ml上清液，加入5ml二氯甲烷 ，充分振荡2分钟；
4. 室温2000g离心5min，去除上层液体；
5. 转移2.5ml下层液体于另外一只玻璃试管中，50-60℃氮流蒸发；
6. 残留物溶于2ml乙腈，摇匀；
7. 用样品稀释液将混合洗出液稀释10倍（50ul乙腈提取液+450ul样品稀释液）；
8. 移取75ul进行分析。
酶交联物制备
试剂盒提供的酶交联物是25倍的，每次使用前都要稀释。
标准稀释液的制备
乙腈和样品稀释液1:9的比例混合使用
标准的制备
标准品浓度（ppb）
标准品稀释液（ml）
标准品
1
4
40 uL
0.5
1
1.0ml 1ppb的标准液
0.1
1.8
0.2ml 1ppb的标准液
0.05
1
1ml 1ppb的标准液
0.025
0.5
0.5ml 0.05ppb的标准液
0.01
0.8
0.2ml 0.05ppb的标准液
0
1.000
0
操作步骤
1. 使用前将试剂盒和样品处理物提前从冰箱中拿出来使其达到室温。装有洗液的洗瓶。
2．从铝箔袋中拿出要求数量的微孔条，放入干燥剂并重新封好袋子以免微孔条受潮。
3. 用移液器吸取75 μl 样品处理物到对应的测试孔 ，同时在每个孔中都加入75 μl 抗体溶液。
4. 轻轻震动30秒使其混匀孵育30分。
5. 孵育完成后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板缓冲液清洗微孔。每孔每次至少加入250ul，微震荡洗涤后倒掉，重复三次，总共四次洗板。拍板，去掉残留的洗液。
6. 每个孔加入150 μL 酶标结合物.
7. 轻轻震动30秒使其混匀孵育30分
8. 孵育完成后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板缓冲液清洗微孔。每孔每次至少加入250ul，微震荡洗涤后倒掉，重复三次，总共四次洗板。拍板，去掉残留的洗液。
9. 每个孔加入150 μL 底物.孵育30分
10. 每孔加入 100 μL 终止液.
11. 450nm 下读取每个孔的吸光度值（OD）
结果分析
1．
半定量结果的判定，可根据样品的吸光度值与标准的吸光度值来判定，样品的吸光度值低于某个标准的吸光度值，则说明样品的孔雀石绿含量大于此标准的浓度，样品的吸光度值高于某个标准的吸光度值，则说明样品的孔雀石绿含量小于此标准的浓度。
2．
定量结果判定，需要以标准的吸光度值为X轴，标准浓度的对数为Y轴绘制曲线图，将标准浓度吸光度值的点用直线连接，样品的吸光度值也位于这条直线上，根据样品的吸光度值在Y轴上即可找到相应样品的浓度，如果样品的吸光度值大于最小标准的吸光度值或小于最大标准的吸光度值，即可说明此样品中孔雀石绿的含量小于0.01ppb或大于1ppb。
3. 当样品的浓度高于1ppb 时要调节稀释倍数来获得最终的浓度。
