高效液相色谱法测定脂溶性维生素
1)原理
试样中的维生素A及维生素E经皂化处理后,将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱反相柱(RP-C18),将维生素A和维生素E分离,经紫外检测器检测,并用内标法定量测定。
2)仪器
①高效液相色谱仪(带紫外检测器)。
②旋转蒸发器。
③高速离心机。
④小离心管:具塑料盖,1.5～30mL塑料离心管(与高速离心机配套)。
⑤高纯氮气。
⑥恒温水浴锅。
⑦紫外检测器。
3)试剂
①无水乙醚:不含有过氧化物。
a. 过氧化物的检查方法 用2mL乙醚,加1mL10%碘化钾溶液,振摇1min,如有过氧化物则放出游离碘,水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉溶液,水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。
b. 去除过氧化物的方法 重蒸馏乙醚时,瓶中放入纯铁丝或铁末少许,弃去10%初液和10%残馏液。
②无水乙醇:不得含有醛类物质。
a. 检査方法 取2mL银氨溶液于试管中,加入少量乙醇,摇匀,再加入氢氧化钠溶液,加热,放置冷却后,若有银镜反应则表示乙醇中有醛。
b. 脱醛方法 取2g硝酸银溶手少量水中,取4g氢氧化钠溶于温乙醇中,将两者倾入1L乙醇中,振摇后,放置暗处2d(不时摇动,促进反应),经过滤,置蒸馏瓶中蒸馏,弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时,硝酸银用量适当增加。
③无水硫酸钠。
④甲醇:重蒸后使用。
⑤重蒸水:水中加少量高锰酸钾,临用前蒸馏。
⑥抗坏血酸溶液(100g/L):临用前配制。
⑦氢氧化钾溶液(1+1)。
⑧氢氧化钠溶液(100g/L)。
⑨硝酸银溶液(50g/L)。
⑩银氨溶液 加氨水至硝酸银溶液(50g/L)中,直至生成的沉淀重新溶解为止,再加氢氧化钠溶液(100g/L)数滴,如发生沉淀,再加氨水直至溶解。
⑪维生素A标准溶液 视黄醇(纯度85%)或视黄醇乙酸酯(纯度95%)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品,使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。
⑫维生素E标准溶液 α-生育酚(纯度95%)、γ-生育酚(纯度95%)、δ-生育酚(纯度95%)。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品,使其浓度大约为1mL相当于1mg三种生育酚。临用前用紫外分光光度计分别标定此三种生育酚溶液的准确浓度。
⑬内标溶液 称取苯并[e]芘(纯度98%),用脱醛乙醇配制成每1mL相当10μg苯并[e]芘的内标溶液。
4)操作方法
(1)试样处理
①皂化 准确称取1～10g试样(含维生素A约3μg,维生素E各异构体约为40μg)于皂化瓶中,加30mL无水乙醇,进行搅拌,直到颗粒物分散均匀为止。加入5mL10%抗坏血酸、苯并[e]芘标准液2.00mL,混匀,加10mL氢氧化钾溶液(1+1),混匀。于沸水浴回流30min,使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。
②提取 将皂化后的试样移入分液漏斗中,用50mL水分2～3次洗皂化瓶,洗液并入分液漏斗中,用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣,乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣,可将此液通过有脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗中。轻轻摇动分液漏斗2min,静置分层,弃去水层。
③洗涤 用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层,用pH试纸检验直至水层不显碱性(最初水洗轻摇,逐次振摇强度可增加)。
④浓缩 将乙醚提取液经过无水硫酸钠(约5g)滤人与旋转蒸发器配套的250～300mL球形蒸发瓶内,用约100mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次,并入蒸发瓶内,并将其接至旋转蒸发器上,于55℃水浴中减压并回收乙醚,待瓶中剩下2mL乙醚时,取下蒸发瓶,立即用氮气吹掉乙醚,立即加入2.00mL乙醇,充分混合,溶解提取物。
将乙醇液移入一小塑料离心管中离心5min(5000r/min)。上清液供色谱分析。如果试样中维生素含量过少,可用氮气将乙醇液吹干后,再用乙醇重新定容,并记下体积比。
(2)标准曲线的绘制
①维生素A和维生素E标准浓度的标定 取维生素A和各维生素E标准液若干微升,分别稀释至3.00mL乙醇中,并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用吸光系数计算出该维生素的浓度。测定条件如表1所示。
浓度按下列公式计算:
式中 c1——维生素的浓度,g/mL;
A——维生素平均紫外吸光值;
V——加入标准液的量,μL;
E——某种维生素1%吸光系数;
——标准液稀释倍数。
②标准曲线的绘制 采用内标法定量。把一定量的维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚及内标苯并[e]芘溶液混合均匀。选择合适灵敏度,使上述物质的各峰高约为满量程70%,为高浓度点。高浓度的1/2为低浓度点(其内标苯并[e]芘的浓度值不变),用此种浓度的混合标准进行色谱分析,得出色谱图。维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标峰面积之比为纵坐标,维生素浓度为横坐标绘制,或计算回归方程。如有微处理机装置,则按仪器说明用两点内标法进行定量。
不能将β-生育酚和γ-生育酚分开,所以γ-生育酚峰中包含有β-生育酚峰。
(3)高效液相色谱分析
色谱条件(参考条件)如下。
①预柱:ultrasphere ODS10μm,4mm×4.5cm。
②分析柱:ultrasphere ODS5μm,4.6mm×25cm。
③流动相:甲醇+水=98+2,混匀,临用前脱气。
④紫外检测器波长:300nm,量程0.02。
⑤进样量:20μL。
⑥流速:1.7mL/min。
(4)试样分析
取试样浓缩液20μL,待绘制出色谱图及色谱参数后,再进行定性和定量。
①定性:用标准物色谱峰的保留时间定性。
②定量:根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值,以此值在标准曲线上查到其含量,或用回归方程求出其含量。
5)计算
式中 X——维生素的含量,mg/100g;
c——由标准曲线上查到某种维生素含量,μg/mL;
V——试样浓缩定容体积,mL;
m——试样质量,g。
计算结果表示到三位有效数字。
6)说明及注意事项
本方法为GB/T5009.82—2003标准第一法。本方法检出限分别为:维生素A:0.8ng;α-生育酚:91.8ng;γ-生育酚:36.6ng;δ-生育酚20.6ng。
