细胞周期测定实验——BrdU渗入法
实验方法原理 | 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。
单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。
BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞DNA复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,就可算出细胞周期的值。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、试剂配制
三、44小时加秋水仙素,使每ml中含0.1 ug。
四、48小时后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。
五、常规染色体制片。
六、染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2xSSC 液,距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。
七、弃去2xSSC液,流水冲洗。
八、Giemsa液染色10分钟,流水冲洗,晾干。
九、镜检100个分裂相,计第一、二、三、四细胞期分裂指数。
十、计算
细胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小时)
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其他 | 一、细胞周期介绍
1. 间期
间期又分为三期、即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。
(1)G1期
(2)S期
(3)G2期
2. 分裂期
细胞的有丝分裂(mitosis)需经前、中、后,末期,是一个连续变化过程,由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1~2小时。
(1).前期(prophase)染色质丝高度螺旋化,逐渐形成染色体(chromosome)。染色体短而粗,强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动,在细胞中形成两极;而后以中心粒随体为起始点开始合成微管,形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化,核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。
(2)中期(metaphase)细胞变为球形,核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面,从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群,共46个,其中44个为常染色体,2个为性染色体。男性的染色体组型为46,XY,女性为46XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状,均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。
(3)后期(anaphase)由于纺锤体微管的活动,着丝点纵裂,每一染色体的两个染色单体分开,并向相反方向移动,接近各自的中心体,染色单体遂分为两组。与此同时,细胞波拉长,并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动,该部缩窄,细胞遂呈哑铃形。
(4)末期(telophase)染色单体逐渐解螺旋,重新出现染色质丝与核仁;内质网囊泡组合为核被膜;组胞赤道部缩窄加深,最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。
在体内根据细胞的分裂能力可把它们分为三类: 展开 |