神经炎症与肌萎缩侧索硬化症关系的研究进展
肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种选择性侵犯上、下运动神经元，引起进行性瘫痪和肌肉萎缩的致命性神经系统退行性疾病，俗称“渐冻症”。目前由于ALS病因仍不清楚，发病机制错综复杂，因此，临床尚缺乏有效的预防和治疗措施。
近年来，多项研究表明神经炎症在介导神经元损伤和疾病进展中起着至关重要的作用。在ALS患者和突变型SOD1小鼠模型的脑干和脊髓等病变组织中出现大量小胶质细胞的活化增殖，T淋巴细胞的浸润以及各种炎症因子的产生，均提示神经炎症参与ALS的发生发展过程。
1.ALS中神经炎症的概述
目前ALS的发病机制尚不明确，可能的机制包括兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、线粒体功能异常、神经丝蛋白异常磷酸化、凋亡和炎性级联反应等。小胶质细胞与星形胶质细胞介导的神经炎症在ALS运动神经元变性中的作用成为近年来研究热点。尽管运动神经元变性、死亡是ALS显著和主要的病理变化，但是越来越多的实验显示小胶质细胞与星形胶质细胞介导的神经炎症以及它们与运动神经元之间的相互作用在ALS发生和发展过程中起重要作用。
研究发现随着ALS临床症状的发展，在ALS患者和突变型SOD1小鼠模型的脑干和脊髓等病变组织中出现大量活化的小胶质细胞和星形胶质细胞。Turner等和Corcia等利用PET技术结合激活小胶质细胞的特性在ALS患者脑中直观观察到激活的小胶质细胞广泛分布在运动皮质、额叶前部、丘脑和脑桥等部位。在突变型SOD1小鼠模型疾病的早期阶段即可病理检测到脊髓组织中大量的小胶质细胞增生浸润，且伴随病情进展至终末期。
激活的小胶质细胞分泌大量的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、白细胞介素-1a（interleukin-1a，IL-1a）、IL-6和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）等炎症因子，同时产生大量的氧自由基引起一氧化氮和过氧化亚硝酸盐水平的升高，如一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和环氧化酶（Cyclo oxygenase，COX），其导致的脂质和蛋白的氧化损伤增加了运动神经元对兴奋性氨基酸毒性的敏感性。激活的小胶质细胞后还可以产生谷氨酸盐，通过激活谷氨酸盐受体引发钙内流，从而对神经元造成兴奋毒性损伤。
另外，小胶质细胞激活后释放大量趋化因子和细胞因子，影响邻近细胞的生长和功能，如形成反应性星形胶质细胞。反应性星型胶质细胞进一步加剧激活小胶质细胞的引起的神经元毒性作用。反应性星型胶质细胞的谷氨酸转运体（GLT-l，在人类称为EAAT-2）的蛋白表达及转运功能明显下降，导致谷氨酸蓄积，并对运动神经元造成兴奋性毒性作用。此外，以抑制神经炎症为靶点的药物如COX-2抑制剂能延缓ALS模型动物的病情发展也从另一个角度表明了神经炎症在ALS中的重要作用。
2.ALS中参与神经炎症过程的细胞
2.1小胶质细胞
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）抵御伤害和感染的第一道防线之一，是先天性免疫系统的重要组成部分，其激活后产生先天免疫应答。小胶质细胞分为MI型和M2型。一般而言，M1被IFN-γ或脂多糖（LPS）激活，促进神经毒性T细胞反应，并且因其分泌活性氧（ROS）和促炎因子（包括IL-1、IL-6和TNF-α），以及减少保护性神经营养因子的分泌而具有细胞毒性。相反，M2具有保护作用，可释放高水平的抗炎细胞因子和神经营养因子，包括IL-4、IL-10和胰岛素样生长因子（IGF）-1，以及与其他神经保护信号分子如fractalkine（CX3CL1）和CD200（OX2）等。
神经元通过表达膜结合蛋白和可溶性介质来调节小胶质细胞的活化，从而产生神经保护性或神经毒性。小胶质细胞神经保护作用主要由两种信号分子，fractalkine和CD200诱导。CX3CL1在应激状态下由运动神经元释放，与fractalkine受体（CX3CR1）结合，而小胶质细胞是表达fractalkine受体的唯一细胞，故认为fractalkine能激活小胶质细胞。向CX3CR1-/-小鼠注射LPS后发现小胶质细胞反应失调，同时去除mSOD1小鼠的CX3CR1后观察到神经元丢失水平增加，这些研究证实了CX3CL1/CX3CR1结合后的神经保护作用。CD200（OX2）信号似乎也在ALS发病机制中起关键作用，在CD200-/-小鼠中小胶质细胞从抗炎和神经保护转变为促炎和神经毒性，释放ROS和促炎细胞因子，导致神经元进一步损伤并启动细胞死亡。而在CX3CR1-/-小鼠中未观察到这些现象，表明CD200/CD200R和CX3CL1/CX3CR1在小胶质细胞作用中具有不同的保护作用。
体外实验发现，突变的mSOD1蛋白也能激活小胶质细胞，这可能是通过CD14（一种错误折叠蛋白的模式识别受体），因为CD14具有共同受体Toll样受体2（TLR-2）和TLR-4。与LPS类似，mSOD1能够与CD14结合，在使用针对TLR2/4或CD14的抗体或通过使用CD14-/-小胶质细胞阻断该通路后，发现促炎细胞因子和自由基的产生减少以及从mSOD1G93A小胶质细胞释放IGF-1增加，从而减弱了神经毒性，增强了小胶质细胞的神经保护作用，表明通过CD14和TLR途径的小胶质细胞激活是ALS的神经病理学标志之一。因此，对小胶质细胞激活机制选择性增强或阻断，可能是潜在的治疗方式。
2.2星形胶质细胞
这是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种，呈星形，它从胞体发出许多长而分支的突起，突起末端常膨大形成终足，彼此连接构成胶质界膜。星形胶质细胞具有许多复杂功能，包括调节细胞外神经递质浓度，发挥代谢或离子稳态功能，为神经元提供结构和营养支持，并且还有助于免疫反应。星形胶质细胞在免疫和非免疫机制中都导致运动神经元损伤。与ALS相关的基因不仅在运动神经元（MNs）中表达，也在星形胶质细胞中表达。已有研究表明体外和体内表达mSOD1的星形胶质细胞对来自携带mSOD1基因的胚胎干细胞（ESC）的MNs和正常MNs都具有毒性。
有趣的是，表达mSOD1的星形胶质细胞选择性地导致ALS中脊髓MNs的死亡，但不导致脊髓GABA能或背根神经节神经元或ESC衍生的中间神经元死亡。在星形胶质细胞中选择性沉默或阻断mSOD1基因或移植健康的星形胶质细胞，可以减弱星形胶质细胞介导的毒性和MNs的损失，从而延缓疾病进展和延长mSOD1小鼠的寿命。在ALS患者和动物模型中，星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白-1（兴奋性氨基酸转运蛋白-2）的表达减少，导致谷氨酸兴奋性中毒。
事实上，在散发性ALS病例的脑脊液中发现谷氨酸盐水平升高。而利鲁唑（一种TTX敏感的钠通道阻断剂，通过阻止钙内流而阻止谷氨酸释放）是目前唯一能在ALS患者中提供治疗效果的药物。星形胶质细胞还可以通过模式识别受体（包括TLR和甘露糖受体）促成免疫反应。激活后，星形胶质细胞可以分泌神经毒性因子和细胞因子，如C-X-X基序趋化因子10，C-C基序趋化因子配体2和IL-6，极大影响局部环境，具体机制有待明确。此外，最近研究表明，特别是在ALS中，星形胶质细胞可以通过产生许多有毒分子，如一氧化氮或过氧亚硝酸盐，导致运动神经元死亡。
2.3T淋巴细胞
T细胞在针对不同抗原的获得性免疫应答中发挥重要作用。在疾病发展过程中，特定的T细胞亚群进入CNS并促进ALS的神经炎症反应。来自ALS患者的尸检样本中观察到CD4+T细胞、CD8+T细胞、激活的小胶质细胞、星形胶质细胞以及由浆细胞产生的IgG沉积物在脊髓中显著积累，提示T细胞参与疾病的免疫反应过程。
值得注意的是，在SOD1G93AALS小鼠研究中，小鼠出现症状后观察到脊髓中CD4+和CD8+T细胞大量浸润，表明了T淋巴细胞参与早期疾病发生发展事件。为了解T淋巴细胞对疾病作用，有研究将mSOD1G93A小鼠的RAG-2基因敲除（缺乏功能性T细胞和B淋巴细胞的重组激活基因2），发现仅表达突变的SOD1且缺乏功能性CD4+T或B细胞的小鼠的疾病进展加速，寿命缩短，但不影响疾病的发生，提示T或B淋巴细胞在疾病发生发展中具有保护作用。
另外，与SOD1G93A/RAG2-/-小鼠相比，敲除T细胞表面的CD4（CD4-/-）的SOD1G93A小鼠显示出更短的生存期，因此可推测CD4+T细胞与延长疾病持续时间和生存期有关。除此之外，与SOD1G93A/RAG2+/-或SOD1G93A/CD4+/-小鼠相比，在疾病末期，在SOD1G93A/RAG2-/-和SOD1G93A/CD4-/-小鼠检测到较少的活化的小胶质细胞，同时，小鼠脊髓中神经营养因子（包括IGF-I、GDNF、BDNF）和抗炎因子的mRNA水平降低，CX3CR1和几种谷氨酸受体水平也降低。
有趣的是，通过骨髓移植，上述因子的水平恢复，提示CD4+T细胞能改变ALS中小胶质细胞和星形胶质细胞的活化状态，并且可以通过调节神经保护和细胞毒性之间的平衡来保护运动神经元。由于大量运动神经元和轴突在症状出现时仍保持完整，免疫系统的作用可能是保护这些剩余的神经元免于退化。
3.ALS免疫治疗的动物实验和临床试验
Celecoxib是FDA批准的COX2抑制剂可阻断前列腺素的合成，前列腺素作为一种炎症介质可以刺激星形细胞谷氨酸释放和谷氨酸兴奋毒性是ALS中已知的病理事件，COX2似乎合乎逻辑治疗目标。来自mSOD1G93A小鼠模型中的研究支持了在ALS中使用COX2抑制剂的大多数临床前数据。Pompl等使用COX抑制剂在SOX1小鼠模型中对疾病进展的潜在重要性进行了测试，结果显示脊髓PGE2抑制，表明该抑制剂药物有效。进一步的，Drachman等和Wosiski-Kuhn等在第28天开始，对SOD1小鼠给予Celecoxib，发现可以显着降低PGE2的脊髓水平，并使存活率增加28d。
在临床研究方面，Meucci等通过静脉注射免疫球蛋白对ALS患者进行治疗，同时加用环磷酰胺，结果显示4～13个月的治疗能减缓ALS进展。此外，在临床研究方面还有Tocilizumab（一种抗人IL6受体的人源化单克隆抗体），经FDA批准用于治疗RA，目前正在进行II期RCT治疗ALS患者，其也是第一个使用免疫或炎症调节疗法的ALS临床试验。
尽管免疫调节疗法对ALS患者在实验性阶段取得了一些进展，但仍存在一定局限性。如药物盐酸芬戈莫德（Fingolimod），是一种鞘氨醇-l-磷酸（S1PR）受体调节剂，起免疫抑制作用，目前已广泛使用于多发性硬化的病人。虽然可以延长晚期SOD1小鼠存活期15d，但未改善病情和体重减轻，未能显示出显著疗效。这可能与缺乏对免疫反应的深刻理解，进而导致免疫治疗的时机不合适有关。
4.神经炎症的干预或者相关免疫治疗
对ALS的影响众所周知，TLR4诱导NF-κB的活化，从而激活促炎细胞因子的转录。最近实验表明体内TLR4的免疫原性在自发运动神经元变性的小鼠模型中具有保护作用，在小鼠脊髓的颈部区域中显示出活化小胶质细胞的下降和TNF-α产生的减少，脊髓运动神经元改变的减少和更好的功能测试性能。在SOD1突变小鼠中，运用TAK-242（一种TLR4抑制剂）抑制TLR4后，小鼠疾病进展延迟，脊髓星形胶质细胞和活化小胶质细胞减少以及运动神经元丢失减少。这些结果表明靶向先天性免疫受体可能对ALS有益。
最近的报道显示，受损的运动神经元在引起周围脊髓小神经胶质细胞增生的情况下表达M-CSF，从而促使另一种致病途径，其中受损的运动神经元会诱发有害的小神经胶质细胞增生。因此，ALS患者以及ALS小鼠模型中M-CSF水平升高，可能是加剧小胶质细胞增生和促进ALS进展的关键途径。有研究表明，酪氨酸激酶抑制剂马西替尼（masitinib，AB1010）在纳摩尔浓度下抑制纯化的重组CSF-1R激酶活性，并在体外减少M-CSF诱导的小胶质细胞增殖和迁移能力。在提取的SOD1G93A小鼠脊髓的小胶质细胞培养中发现，马西替尼阻止CSF诱导的增殖，细胞迁移和炎症介质的表达。
此外，在SOD1G93A大鼠出现麻痹症状后进行马西替尼口服治疗，相对于对照组小鼠，实验组小鼠退化脊髓中的异常神经胶质细胞，小神经胶质细胞和受损的运动神经元数量均有减少。马西替尼治疗在瘫痪发作7d后开始，延长了40%的瘫痪小鼠的存活率。
5.结论
尽管运动神经元变性、死亡是ALS显著和主要的病理变化，但是越来越多的研究显示小胶质细胞、星形胶质细胞以及T淋巴细胞介导的神经炎症在ALS发生和发展过程中起重要作用。当前针对ALS还缺乏有效的预防和治疗手段，仅药物利鲁唑被FDA批准用于ALS的治疗，但是其效果也是相当微弱。
目前几种针对免疫系统的药物，如TLR4抑制剂等，已经在动物实验中取得一定疗效，虽然在临床实验中仍存在局限性。但随着神经炎症在ALS发生发展过程的作用被阐明，免疫治疗可能是最有前景的策略。对ALS的病理生理学的更好理解将为ALS提供了新的治疗干预方式。
