免疫荧光技术(immunofluorescence technique)-1
免疫荧光技术(immunofluorescence
technique)是一种以荧光物作为标记物的免疫分析技术，荧光物质分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态而极不稳定，其迅速回到基态时，可以电磁辐射形式释放出所有的光能，发射出波长较照射光长的荧光。用荧光素与已知的抗体（或抗原，较少用）结合，但不影响其免疫活性，然后可将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物。
常用的荧光素主要有：
1 ．异硫氰酸荧光素 (FITC) ，最大吸收光谱为 490~495nm ，最大发射光谱为 520~530nm ，呈黄绿色荧光。
2 ．四乙基罗丹明 (RB200) ，最大吸收光谱为 570nm ，最大发射光谱为 595~600nm ，呈明亮橙色荧光。
3 ．四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) ，最大吸收光谱为 550nm ，最大发射光谱为 620nm ，呈橙红色荧光。
一、 FITC 标记抗体技术
在碱性条件下， FITC 的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰氨化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。
目前一般实验使用的荧光抗体多为商品化试剂，不需自己合成。
二、荧光抗体染色法
实验原理
荧光抗体染色技术的基本原理是利用抗原抗体特异性结合的特点，用标记有荧光素的荧光抗体检测待检抗原样本，如形成抗原抗体复合物，则其在蓝紫光或紫外光照射下发出荧光，用荧光显微镜进行观察。本实验常用于测定细胞表面抗原和受体，各种病原微生物的快速检查和鉴定，组织内抗原的定性和定位研究以及各种自身抗体的检测等。经典的荧光抗体技术包括直接法、间接法和补体法。
实验材料
1 ．抗原 呼吸道合胞病毒 (RSV) （或待检标本）
2 ．细胞 Hep-2 （或 Hela ）细胞单层
3 ．荧光抗体 1:40 抗 RSA IgG-FITC 标记物； 1:40 抗兔 IgG-FITC 标记物
4 ．中间抗血清 1:200 兔抗 RSV 免疫血清 (Abt)
实验方法
1.制备抗原片
⑴ RSV 感染细胞：用 RSV 感染 Hep-2 或 Hela 细胞单层培养物，在细胞未出现 CPE 前，用胰酶消化使分散，并配制成 4-6
′ 10 5 个 /ml 的细胞悬液，用吸管将细胞悬液滴加到 10 点镀膜玻片上，每个圆点上约 0.025ml
，再将镀膜玻片放入二氧化碳孵箱， 37 ° C 培养 6~24 小时。培养后的玻片用 pH7.4 的 PBS 漂洗 3 次，干燥后固定。
⑵ 固定：将玻片放入盛有冷丙酮的洗缸中， 4 ° C 固定 20 分钟，漂洗，自然干燥。
⑶ 抗原片的保存：固定好的抗原片最好立即进行荧光抗体染色，若必须保存时，置于低温下密闭保存备用。
2.荧光抗体染色法
⑴ 直接染色法 直接使荧光抗体与玻片上的抗原反应。
① 用吸管滴加 1:40 抗 RSV IgG-FITC 标记物，使其布满整个标本区。将玻片置湿盒中， 37 ° C 孵育 30 分钟。
② 将玻片取出，用自来水冲去多余的标记抗体液后，用 PBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。最后用蒸馏水冲洗 1 次，晾干。
③ 用纯度高的甘油封片，镜检。
⑵ 间接染色法
① 用吸管吸取 1:200 兔抗 RSV 免疫血清，滴于抗原片上，使其布满整个标本区，约 0.025ml 。将玻片置湿盒 37 ° C 孵育 30~40 分钟， PBS 漂洗 3 次，每次 2 分钟。
② 滴加 1:40 抗兔 IgG-FITC 标记物于抗原片上，约 0.025ml 。将玻片置湿盒 37 ° C 孵育 30~40 分钟， PBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。标本不要太干，各染液勿混流。
③ 0.02% 伊文思蓝覆盖 5 分钟，去染液加甘油封片，镜检。
结果判定
荧光显微镜下所观察到的荧光图象主要以两个指标判断结果，一是形态学特征，一是荧光的亮度，必须将两者结合起来综合判断。
特异性荧光呈黄绿色，其强度用“ ++++ ”、“ +++ ”、“ ++ ”、“ + ”、“—”表示。
思考题
1. 何谓免疫标记技术？常用的免疫标记法有那些？
2. 荧光抗体染色的原理是什么？有那些常见方法？
酶联免疫吸附实验（间接法）
酶联免疫吸附实验 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
是一种用酶标记抗体或抗原，对相应的抗原或抗体进行测定的免疫标记技术。他利用了抗原抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体，具有敏感性高、特异性强、简单、结果便于观察、可用于大规模快速检测等特点。常用方法有直接法、间接法、夹心法和竞争法等。
常用标记酶有：辣根过氧化物酶 (HRP) ，碱性磷酸酶 (AP) ，葡萄糖氧化酶 (GOD) 等。
实验原理
先将用于检测特异性抗体的已知抗原结合到固相载体上，再先后加入待测抗体和酶标二抗进行反应，其间通过洗液的洗涤去除未能固化到固相载体上的成分，这样因为抗原抗体反应的特异性，就保正了只有当检测标本中含可与已知抗原特异性结合的抗体时，标记的酶才能在反应孔中存在而不被洗去，当加入酶的底物后，底物被酶催化产生有色的产物，通过目测或分光光度计检测 OD 值就可测出底物的降解量，从而推知存在于标本中的抗体量。
