MaxCyte流式电转染平台在新一代疫苗快速研发生产中的...
MaxCyte流式电转染平台在新一代疫苗快速研发生产中的优势分析
日前，新型冠状病毒（COVID-19）疫情仍在持续发展，截至目前，累计确诊病例数已超过70000。尽管统计数据在不断增加，但全国乃至全球抗击疫情的决心和信心越来越强。对于疫情防控，其中最重要的研究工作是要尽早研发出针对2019-nCoV感染的预防性疫苗。研究表明，如果人群中有70%以上的人接种了相应疫苗，就有可能有效阻断病毒在人群中的广泛传播。对普通民众来说，疫苗仍然是防控传染病最有效的手段。大家越来越关心疫苗研制目前在什么阶段、什么时候能够上市。
那么，什么是疫苗？疫苗研发需要多久？疫苗是将病原微生物（如细菌、病毒、立克次体）及其代谢产物，经过人工减毒灭活或利用基因工程等方法制成的，用于预防传染病的自动免疫制剂。18世纪末英国人简纳（E.Jenner）在人痘接种基础上发明了牛痘接种术，标志着历史上第一剂疫苗发明，是古典疫苗时期的开始。随着微生物学的发展及当时霍乱、炭疽杆菌以及狂犬病，19世纪末法国科学家巴斯德通过系统的科学实验，将病原微生物进行培养、减毒或灭活，使其毒力降低或消失，制出了鸡霍乱杆菌菌苗、炭疽菌苗、狂犬病毒疫苗等。最近几十年遗传学、分子生物学、基因工程等学科得到飞速发展，研制疫苗的技术水平也不断提升。科学家通过提取或人工合成病原微生物的有效抗原成分而制成亚单位疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗等，这类疫苗安全，副作用较少，无毒力返祖的危险。
对于甲流等大规模流行性传染疾病，疫苗的生产主要还是利用传统方法，以鸡胚为载体来培养种子毒株，获得灭活或减毒疫苗，但研发及生产周期较长，当年SARS灭活疫苗研制出来的时候病毒都已经销声匿迹，甚至都没有在临床上进行使用。据报道，国内外超过30家团队已经开展针对新冠病毒的疫苗研发，其中核酸和重组蛋白等疫苗研发团队不仅占据了大多数，而且进展也相当快，美国Moderna公司和上海斯微的mRNA疫苗、中科院微生物所的重组蛋白疫苗等已经在进行动物实验。
当前部分新冠病毒疫苗研发机构和企业
| 机构/企业 | 疫苗类型 |
| 中国疾控中心 | 传统灭活疫苗 |
| 浙江大学传染病诊治重点实验室 | 传统灭活疫苗 |
| 斯微生物/同济大学医学院 | mRNA疫苗 |
| 中科院先进技术研究院 | mRNA疫苗 |
| 美国Moderna公司 | mRNA疫苗 |
| 美国CureVac公司 | mRNA疫苗 |
| 美国Inovio公司 | DNA疫苗 |
| 中科院微生物研究所 | 重组蛋白疫苗 |
| 香港大学医学院 | 重组蛋白疫苗 |
| 澳大利亚昆士兰大学 | 重组蛋白疫苗 |
| 成都三叶草生物制药 | 重组蛋白疫苗 |
| 武汉博沃公司/美国GeoVax Labs | 病毒载体疫苗 |
| 美国强生公司 | 腺病毒载体疫苗 |
疫苗是目前人类唯一可以有预测地消灭某一疾病的有效武器，但是疫苗本身也存在局限性，病毒一旦发生变异，原有的疫苗也即失去功效。且疫苗研制周期漫长，得益于核酸、重组蛋白等新型疫苗研究技术，目前针对COVID-19的疫苗最早4月份进入临床实验，比SARS疫苗研制进展提高了很多，但是距离上市还有相当一段时间，面对此次传播力如此强的病毒，疫苗早一天上市就可能多挽救一批奋战在一线的医务人员及无辜感染者。
MaxCyte流式电转染平台—助力快速高效抗体疫苗研发
MaxCyte公司是全球电转领域的先行者和技术领导者，专注细胞电转技术超过20年，提供全球领先的细胞转染解决方案，其ZL性的通用型流式电转染技术是经临床验证的快速、高质量细胞转染平台，能够将DNA、RNA、siRNA、蛋白质或细胞裂解物转染到各种细胞系和原代细胞中，系统内置多种经过验证的电转实验方案，转染效率和细胞存活率可达90%以上，能够在30分钟内转染多达2×1010个细胞，放大生产无需再次优化转染流程，适用于前期研发、临床实验到商业化生产全过程，且符合cGMP生产规范，操作简单，系统“即插即用”。 MaxCyte转染平台可用于重组蛋白和疫苗研发及生产，高性能瞬时转染技术能够快速开发和制造完整、大量的新一代疫苗，包括治疗性抗体和抗体样分子、亚单位疫苗、病毒样颗粒（VLPs）、病毒样复制子颗粒（VRPs）和病毒载体，无需其它稳定表达细胞、杆状病毒、脂质体或化学转染方式，能够大大缩减抗体和疫苗从研制到上市的时间。
MaxCyte通用流式细胞电转染平台
MaxCyte瞬时转染—实现快速大量抗体蛋白生产
图1. 高性能瞬时转染 图2. 快速大量蛋白生产
MaxCyte系统利用流式电转染技术转染原代细胞、哺乳动物细胞、干细胞和昆虫细胞，具有高转染效率和细胞活率，实现细胞、细胞表面或分泌蛋白的高水平表达。MaxCyte瞬时转染平台可快速生产大量用于治疗或疫苗的蛋白质，包括单特异性和多特异性抗体、VLP、VRP、包膜蛋白、其他重组蛋白，以及来自CHO、HEK、Vero、昆虫细胞和各种其他细胞系的病毒载体。MaxCyte瞬时转染CHO细胞在两周内能够获得大于1g/L抗体产量，满足临床前实验所需蛋白量，且放大生产无需重新优化转染方法，无论是少量还是大量转染产量都具有极高的稳定性，可极大缩短抗体研发到生产的时间。此外，流动电转染的高转染效率和细胞存活率使得在瞬时运行的同时选择稳定的细胞系，进一步简化抗体的研发流程，可在转染后8周内产生高产稳定的克隆。
MaxCyte助力新一代疫苗快速研发生产
利用MaxCyte流式电转染系统直接转染昆虫细胞，不使用杆状病毒做载体，从质粒到蛋白表达的时间缩短到数天（图3）。对于大规模传染病病、生物防御及季节性流感的快速反应疫苗生产会有很大帮助。MaxCyte转染过程的简单性能够顾及到区域性的“盒装疫苗”生产设施，同样的平台也可用于其他相关细胞类型的生物制造，如CHO、HEK、Vero和MDCK细胞。
MaxCyte用于病毒载体、VLP和疫苗生产的优势：
无缝放大生产， 30分钟内转染多达2×1010个细胞
适用多种病毒生产细胞系
无需杆状病毒系统在数天内获得目的蛋白
能够共转染多个质粒或大质粒
软件控制，封闭转染环境
FDA批准的细胞转染技术
MaxCyte快速获得高质量VLPs疫苗
病毒样颗粒（VLP）比灭活或减毒活病毒疫苗具有更高的安全性，是很有前景的疫苗生产技术。VLPs由一个或多个重组表达的病毒结构蛋白组成，这些蛋白自组装成复合物，紧密模仿原生病毒的三维结构，可用于多种病毒，包括流感病毒。VLPs是用包括哺乳动物和昆虫细胞在内的多种细胞制造的。因为它们在翻译后以类似哺乳动物细胞的方式修饰蛋白质。虽然瞬时转染和重组杆状病毒平台都是昆虫细胞蛋白表达的常用方法，但MaxCyte电转染技术为VLP的产生提供了一种更快速和直接的方法。
通过MaxCyte电转染将编码三种VLP抗原的表达载体转染到SF9细胞，同时，杆状病毒表达系统被用于产生含有相同三种抗原的VLPs。在48小时内经电转染的细胞即开始显著分泌VLP，细胞上清液的SDS-PAGE分析显示，在电转染和杆状病毒样本中均存在三种VLP抗原，但杆状病毒感染细胞的上清液中也存在杆状病毒蛋白污染物，利用MaxCyte电转染技术直接转染昆虫细胞具有极其快速和高质量的特性，通过消除杆状病毒的使用，简化了VLP的生产流程。
图3. MaxCyte生产SF9 VLP：2-4天内实现质粒转化为蛋白质。用一个编码三种抗原的质粒通过小规模电转染转染SF9细胞，共组装成VLPs。从电转后或杆状病毒感染后不同时间中收集细胞培养液，并用SDS-PAGE进行分析。
MaxCyte显著提高VRPs产量
Alphaviruses具有广泛的细胞倾向性，但优先感染树突状细胞，来充当抗原呈递细胞（APCs）的传递载体，进而刺激体液和细胞免疫反应。甲病毒衍生颗粒VRPs（病毒样复制子颗粒），代表了下一代疫苗研发技术，特别是针对NIH风险3组病毒（如H5N1、HIV、埃博拉等），因为低生物接触设施可用于生产非致病性VRPs。VRP对致病因子和癌症免疫治疗的作用已经被评估，并证明在多种动物和人类中是安全的，并能诱导保护性免疫。
VRP的制备是通过表达抗原（以mRNA或DNA质粒的形式）的甲病毒载体和表达甲病毒结构蛋白的辅助RNA或DNA质粒瞬时（共）转染细胞，然后收获含有VRP的培养基，Vero和BHK是最常用的细胞系，但其他的包括CHO和HEK也被使用。通过Vero细胞电转染产生的VRPs已进入临床研究。
电转染技术是一种高效转染Vero细胞的方法。利用MaxCyte进行甲病毒VRP实验，比较了当前的最优方法。评估两种VRP的制备，一种表达绿色荧光蛋白，另一种表达HIV-Gag蛋白。对于这两种转染方法，基于RNA的辅助结构支持更高水平的VRP产生，特别是对于基于MaxCyte电转染的方法，其VRP产生率是使用RNA的5倍。当使用RNA复制子和RNA辅助子时，电转染导致GFP和HIV-Gag表达VRPs的产量比当前最佳方法高9倍。
图4. MaxCyte电转染转染技术产生显著增加的VRP产量
此次新冠病毒给中国造成了巨大创伤，相信疫情终将过去，我们的生活也终将归于平静，但是人类和病毒的较量永远不会停止，人类研发疫苗的脚步也不会停止。无论是高致病性的H1N1、COVID-19、SARS，或是高致死率的MERS、Ebola，还是人类斗争了几十年的HIV等，每一次面对病毒的进攻人类好像始终都没有做好充足准备，而且你永远无法预知下一次病毒爆发是什么时候，除了保持警惕防患未然，或许我们还需要做的是让我们武器库里的武器始终保持锋利。我们期待疫情即早得到控制，我们期待疫苗研发及早成功利国利民！
