虽然理论上 M13 重组噬菌体所能携带的外源 DNA 片段没有限制，但实际上是有限的：长片段的外源 DNA 比短片段的更易发生缺失和重排。因此如果可能，最好克隆至 M13 噬菌体的 DNA 片段不要大于 1000 碱基。而且，当用“正向”或“反向”通用测序引物进行 DNA 测序时，大片段的中心区域可能位于所能测到的区域外。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
| 实验方法原理 | 虽然理论上 M13 重组噬菌体所能携带的外源 DNA 片段没有限制，但实际上是有限的：长片段的外源 DNA 比短片段的更易发生缺失和重排。因此如果可能，最好克隆至 M13 噬菌体的 DNA 片段不要大于 1000 碱基。而且，当用“正向”或“反向”通用测序引物进行 DNA 测序时，大片段的中心区域可能位于所能测到的区域外。 |
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| 实验材料 | 噬菌体 T4 DNA 连接酶限制性内切核酸酶外源 DNA测试 DNAM13 噬菌体载体DNA带有 F' 质粒的适当大肠杆菌菌株的感受态细胞大肠杆菌 F' 铺板菌体 |
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| 试剂、试剂盒 | ATP乙醇IPTG酚氯仿乙酸钠TEX-gal |
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| 仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶YT 或 LB 琼脂平板YT 或 LB 培养基YT 或 LB 上层琼脂或琼脂糖培养管加热器冰浴水浴 |
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| 实验步骤 | 一、材料
1. 缓冲液和溶液
ATP (10 mmol/L)
乙醇
IPTG ( 20%, m/V)
酚: 氯仿（1:1, V/V)
乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
X-gal (2%, m/V)
2. 酶和缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.8%) 悬于 1 X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
4. 核酸和寡核苷酸
外源 DNA
测试 DNA
5. 培养基
YT 或 LB 琼脂平板
YT 或 LB 培养基
YT 或 LB 上层琼脂或琼脂糖
6. 专用设备
培养管（5 ml 或 15 ml, 如 Falcon 2054 或 2006, Becton Dickinson), 预冷至 0℃
加热器，调至 47℃
冰浴
水浴，调至 12~16℃ 和 42℃
7. 载体和菌株
M13 噬菌体载体 DNA (RF)
带有 F' 质粒的适当大肠杆菌菌株的感受态细胞
大肠杆菌 F' 铺板菌体
二、方法
载体 DNA 的制备
1. 用 3~5 倍过量的适当限制酶完全消化 1~2 μg M13 噬菌体 RF DNA，设立一个含 M13 RF DNA 而无限制酶的对照。
2. 温育将结束时，每个反应管取少量 DNA 样品（50 ng), 用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分析消化程度。如果消化不完全（如还有可见的闭合环状 DNA), 加入更多的限制酶并继续温育。
M13 RF DNA 制品可能含有一定量的单链 M13 DNA, 这些 DNA 在琼脂糖凝胶电泳时呈迁移较快的模糊条带，由于单链 DNA 不能被绝大多数限制酶所切割，因而在对照和样品中这些带应一致。
3. 消化完全后，酚: 氯仿抽提，然后在 0.3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2)存在下，用标准的乙醇沉淀方法纯化 M13 DNA。然后将 DNA 以50 μg/ml 的浓度溶于 TE ( pH 8.0)。
4. 如果需要，用小牛碱性磷酸酶或虾碱性磷酸酶处理，使线状载体 DNA 脱磷酸。脱磷酸反应结束后，用加热或用蛋白酶 K 消化使碱性磷酸酶失活，然后再用酚：氯仿抽提。
5. 用步骤 3 的方法回收线状 M13 DNA。将脱磷酸的 DNA 以浓度为 50 μg/ml 溶于 TE ( pH 7.6)。
用于克隆的外源 DNA 的制备
6. 独立的外源 DNA 限制性片段可通过适当的限制酶切和琼脂糖凝胶电泳纯化得到。制备的外源 DNA 以浓度为 50 μg/ml 溶于 TE (pH 7.6)。
连接
连接互补的黏性末端时，请按以下步骤 7~9。建立平末端连接反应，请看方案“在质粒载体中进行平末端片段的克隆实验”。
7. 在一个微量离心管（管 A ) 中，将约 50 ng 载体 DNA 和摩尔数 1~5 倍过量的目标 (外源）DNA 混合，混合体积不超过 8 μl。如果需要，加入 TE ( pH 7.6 ) 将体积调整至 7.5~8.0 μl。设立以下对照：
8. 在所有四个反应管中（管 A~D) 各加入 1 μl 10X 连接缓冲液和 1 μl 10 mmol/L ATP。
9. 在管 A、B 和 D 中各加入 0.5 Weiss 单位噬菌体 T4 DNA 连接酶。各管轻拍管壁数秒混合内容物。12~16℃ 连接反应 4~16 h。
转化
10. 用 YT 或 LB 培养基，37℃ 持续振荡制备过夜培养的铺板菌体。
11. 从 -70℃ 冰箱取一支带有 F' 质粒的所需菌株的感受态细胞，室温融化，置于冰上 10 min。
12. 在 16 支预冷至 0℃ 的 5 ml 无菌培养管（Falcon 2054, Becton Dickinson) 中各加入 50~100 μl 的 F' 细菌感受态细胞。
13. 立刻在含有感受态细胞的各培养管中分别加入连接反应产物和对照（管 A~D ) 各 0.1、1.0 和 5 μl。轻拍管壁数秒混合细菌和 DNA。冰上放置 30~40 min。另设两个转化对照，一个含 5 pg M13 噬菌体 RF DNA, 另一个不加 DNA。
14. 在连接的 DNA 与感受态细胞温育的同时，准备 16 支备含 3 ml 融化的 YT 或 LB 上层琼脂的无菌培养管，置于 47℃ 加热器或水浴上，直至步骤 16。
15. 将含有感受态细菌和 DNA 的培养管移至 42℃ 水浴，温育，立刻将培养管移回冰水浴。
转化细胞铺板
16. 在步骤 14 准备的含融化的上层琼脂的培养管中加入 40 μl 2% X-gal, 4 μl 20% IPTG 和 200 μl 过夜培养的大肠杆菌细胞（步骤 10), 温和振荡数秒混合内容物。 将各转化细胞分别加入各培养管中，加盖温和颠倒三次，依次将备管中的内容物倒至作好标记的 LB 琼脂平板，转动平板，使菌和上层琼脂铺均匀。
使上层琼脂在琼脂平板上完全铺平可能有些困难，特别是第一次使用大平板（直径 15 cm) 时。铺板前， 先将琼脂平板在 37℃ 预热 30~60 min，可以减慢上层琼脂凝固的速度（这样转动平板这一步就有更多的时间）。上层琼脂温度高于 47℃ 会杀死感受态细菌（并明显降低转化率）。
17. 盖上平板，室温凝固 5 min, 用 Kimwipe 纸巾吸干平板盖上的冷凝水，倒置平板，37℃ 培养。 |
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