基因工程的载体-3
⑷基因组成
lDNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段。
3. l噬菌体载体的类型
插入型 （Insertion vectors ）
这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。
如：λgt10 、 λgt11
克隆能力小，不到10kb
置换型 （Replacement vectors）
这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段是λ噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。
如Charon 4 载体
克隆能力大，20～25kb
（二）M13噬菌体
1、丝状噬菌体M13噬菌体的生物学特性
⑴是单链闭合环状噬菌体
只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约6.4kb，可分为10个区和507 bp基因间隔区（IS区），该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。
⑵复制与增殖（图）
2. M13噬菌体载体的构建
⑴ 在IS区内插入LacZ基因 ⑵在标记基因区内组装MCS区段
所以能通过a互补在X-Gal/ IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等
这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。
（三）柯斯质粒载体
1.柯斯质粒载体的特点
柯斯质粒是一类人工构建的含有lDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。
柯斯质粒的大小为4-6kb，
由3部分组成：
A.多克隆位点区
B. 含有cos位点的lDNA区
C. 复制起始位点和抗性标记区
2.柯斯质粒载体的特性
1、具有l噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。
2、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。
3、高容量的克隆能力 cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。
四种常用载体的比较
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质粒 |
λ噬菌体 |
柯斯质粒 |
单链噬菌体 |
|
|
克隆DNA大片段 |
±* |
+ |
+ |
- |
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构建基因组文库 |
- |
+ |
+ |
- |
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构建DNA文库 |
+ |
- |
- |
- |
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常规的亚克隆化 |
+ |
- |
- |
- |
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构建新型的DNA结构 |
+ |
- |
- |
- |
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序列分析 |
+ |
- |
- |
+ |
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单链探针 |
+** |
- |
- |
+ |
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外源基因在大肠杆菌中的表达 |
+ |
- |
- |
- |
